循環外泌體微RNA在支氣管哮喘中的作用綜述

陳儀婷，趙安達，李 榮，康文慧，李生慧

1.上海交通大學公共衛生學院，上海 200025；2.上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院營養科，上海 200011

據統計，目前全球約有3 億人患支氣管哮喘（簡稱哮喘），且患病率正呈指數級增長，預計到2025年，將有1億的新增哮喘患者［1］。哮喘是一種遺傳和環境因素共同作用的異質性疾病，其病理特點復雜，臨床表現各異，缺乏靈敏、有效的診斷方法；作為一種慢性疾病，它目前尚無法徹底治愈，只能通過規范用藥緩解癥狀，使病情在一定程度上得到控制［2］。臨床上根據哮喘的嚴重程度來確定用藥的劑量和頻率，因此準確判斷哮喘病情分級是治療的關鍵。目前主要根據患者的臨床癥狀和第一秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in one second，FEV1）進行哮喘的病情分級。然而，據報道20%～73%的哮喘患者被漏診或病情被低估，延誤了治療［3］。目前尚未有研究證實存在敏感的生物標志物可用來判斷哮喘的病情和表型、預測患者的治療效果及預后。越來越多的證據表明哮喘受到各種外泌體的調節。因此，了解外泌體在哮喘發病機制中的作用，有助于發現特異性的生物標志物用以早期診斷和開發有效的治療方法，并對哮喘預后作出準確評估［4］。微RNA（microRNA，miRNA）有作為診斷哮喘的生物標志物的潛在價值，但外周循環中的miRNA易受其他成分的干擾，導致以往該領域的研究結果尚不一致［5］。外泌體具有雙層膜結構，可抵抗血液中核糖核酸酶的降解，使循環外泌體miRNA 具有高穩定性，是一種理想的生物標志物［5］。既往研究多關注肺部以及氣道微環境中的外泌體在哮喘中的作用［6］。在這篇綜述中，我們總結了血液中的循環外泌體miRNA作為哮喘診斷、表型鑒別、病情進展和預后療效判斷的生物標志物的最新進展。

1 循環外泌體miRNA

外泌體是直徑為30～100 nm 的細胞外微小囊泡，主要由體細胞分泌，分布于血漿、血清、乳汁等體液中；其內容物成分通常由生物分子組成，如脂質、蛋白質、短肽鏈、DNA 片段、RNA［包括信使RNA（messenger RNA，mRNA）以及miRNA］等［7］。其中，miRNA 是一類內源性短鏈非編碼RNA，長度為19～25 個核糖核苷酸［8］。除細胞中的miRNA 外，血液、尿液等體液中還有以游離形式存在的miRNA，其中在血液中的游離miRNA 被稱為循環miRNA［9］。2008 年，循環外泌體miRNA 首次在人體外周血中被發現，其具有高度穩定性，比傳統蛋白質組學生物標志物更高效［9］。

外泌體在形成過程中會選擇性地裝載miRNA 等物質，從而反映分泌細胞的病理生理狀況［10］。循環外泌體miRNA 穩定性的前提是外泌體外層的磷脂雙分子層結構，該結構能夠保護其內容物免受血液中各種酶類物質的影響，確保外泌體在血液循環過程中其內包含的miRNA 在分泌細胞和靶細胞之間實現穩定的、遠距離的表觀遺傳信息傳遞；這是一種新發現的生物信息傳遞機制［11］。且miRNA 在轉錄后調控基因的表達中具有特異性，參與炎癥反應、細胞增殖、分化及凋亡等生理過程，調控多種疾病的發展，因此其具有的生物標志物潛力受到廣泛的關注。

2 哮喘的病因

隨著分子生物學技術的發展，哮喘發病機制的假說也不斷得到更新。目前，學者［12］普遍認為哮喘發病和病情進展與多種機制存在關聯，主要是氣道炎癥和氣道重塑機制。其中，氣道炎癥在哮喘發病過程中發揮著重要的調節作用。哮喘的主要病理生理特征表現為輔助性T 細胞2（T helper cell 2，Th2）和2 型固有淋巴細胞（type 2 innate lymphoid cells，ⅠLC2）釋放促炎因子［如白細胞介素-4（interleukin-4，ⅠL-4）、ⅠL-5、ⅠL-13 等］，氣道嗜酸性粒細胞增多，呼出一氧化氮水平升高。這一炎癥反應對氣管的持續性損傷導致氣管壁結構發生變化（如基底膜增厚、平滑肌細胞肥大或增生、膠原纖維增生、彈性組織破壞、黏膜化等），即出現氣道重塑，并伴隨著氣道高反應性的持續存在。

3 循環外泌體miRNA與哮喘間的聯系

目前已有大量研究提示miRNA 在哮喘的診斷、病情嚴重程度和表型判斷、預后預測中起到重要的作用。然而，大部分研究集中于淋巴細胞、支氣管上皮細胞和免疫細胞源性外泌體miRNA 在其原代細胞和器官中的調控作用［6］。而循環外泌體miRNA 具有穩定且易于檢測的特性，能夠被遠處的細胞吸收進行信號轉導，調節免疫應答和參與相關炎癥性疾病的發生發展，成為許多免疫性疾病的關鍵信號調節分子。目前針對循環外泌體miRNA 與哮喘之間的研究較少，現有的數據結果提示其具有成為診斷、鑒別和反應哮喘治療效果的生物標志物的潛力。

3.1 哮喘臨床診斷

哮喘早期癥狀輕微，可能無明顯癥狀，若不及時有效控制氣道炎癥，少部分患者在接觸誘因后可出現急性發作，嚴重時危及生命。此外，即使無急性發作情況，反復的發作也會加重氣道重塑，導致肺功能的不可逆損傷。所以，哮喘防治的關鍵在于是否能夠早診斷、早治療。

目前，人群研究［13-20］的結論均提示：哮喘患者循環外泌體miRNA表達失調，與健康對照存在差異。2015年，ⅠSHMAEL等［13］從38例哮喘患者和29例非哮喘患者的血液中分離出miRNA，首次表明哮喘患者與非哮喘患者中30 種miRNA（21 種增加，9 種減少）存在表達差異，并進一步提出miR-570-3p 和miR-155 可誘導氣道上皮細胞產生大量細胞因子，初步提示miRNA 的差異性表達可能通過參與氣道炎癥反應參與到哮喘的病情發展。一項研究［15］則直接選擇將重度哮喘患者（n=30）與健康人群（n=30）的血漿外泌體miRNA 做對比，除發現多種外泌體表達水平的差異外，還證實血漿外泌體miR-125b 的上調與高水平的免疫球蛋白E（immunoglobulin E，ⅠgE）和C 反應蛋白（C-reactive protein，CRP）相關，但沒有對miR-125b 具體的信號通路做進一步的探究；該研究結果再次提示miRNA 可作為重度哮喘患者炎癥水平的生物標志物。此外，一項在成人哮喘患者（n=35）和健康受試者（n=15）的研究中首次關注了中性粒細胞表型哮喘患者血漿中miRNA 水平［18］；發現具有中性粒細胞表型的患者更容易對皮質類固醇藥物產生不良反應，從而增加疾病的嚴重程度并導致難以控制的哮喘［21］；研究［18］結果提示miRNA-199a-5p僅在中性粒細胞中被誘導，水平較健康對照顯著升高，通過Wnt、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mamalian target of rapamycin，mTOR）和Hippo 信號通路參與哮喘的氣道重塑過程。綜合以上研究，外泌體miRNA 在哮喘患者與健康人群間存在差異性表達，目前研究主要認為其通過參與氣道炎癥反應參與到哮喘的發展進程中；而在中性粒細胞型哮喘中，外泌體miRNA主要參與哮喘的氣道重塑過程。

3.2 哮喘嚴重程度和表型鑒別

鑒別哮喘患者的嚴重程度和不同表型，分級、分類治療哮喘患者，對確保哮喘治療的延續性、準確性有著重要的作用。目前大部分研究［14，17，19-20，22-25］表明，部分循環外泌體miRNA 表達水平與哮喘的嚴重程度呈正相關，能鑒別不同嚴重程度、不同表型的哮喘，具有作為臨床上判斷哮喘嚴重程度和表型的無創性診斷生物標志物的潛力。

哮喘的嚴重程度主要分為輕度、中度、重度持續以及間歇狀態。王湘云等［14］的研究在未經治療的哮喘患者（n=82）和健康對照（n=80）中，發現除了哮喘患者與健康人群血清中外泌體miR-21的表達水平存在差異外，血清外泌體miR-21表達水平還與哮喘嚴重程度呈正相關（r=0.974，P=0.016 7），對間歇狀態、輕度持續、中度持續、重度持續哮喘患者診斷的受試者操作特征曲線（receiver operator characteristic curve，ROC曲線）曲線下面積（area under the curve，AUC）分別為0.657、0.769、0.847、0.916。另一項研究［22］在血清外泌體miR-125b 中發現了類似的結論，其對間歇狀態、輕度持續、中度持續和重度持續哮喘患者診斷效果的ROC 曲線的AUC 比前者高，分別為0.777 0、0.857 3、0.911 1 和0.999 5；提示將來的研究可納入多種miRNA 來對哮喘嚴重程度進行鑒別，以達到更好的診斷效果。近期的一項研究［17］根據既往的文獻積累，選擇性地提取了血漿中的miRNA，并發現與健康對照組（n=24）相比，中度哮喘患者（n=22）中miR-223 和miR-21 顯著上調，對中度哮喘患者診斷的敏感度分別為83%和76%；但與以往研究結果不一致的是，與中度哮喘患者和對照組相比，重度哮喘患者中miR-21 表達明顯下調。導致這一差異的原因可能是由于樣本量的不足，從外泌體中提取的miRNA 濃度不夠，以及一些環境因素干擾了miRNA的表達。

除了嚴重程度的判別外，在不同表型中，如過敏性哮喘和非過敏性哮喘成年個體中，miRNA 表達譜也存在差異表達；與健康對照相比，miR-155和miR-146a 在過敏性哮喘患者中表達增加，在非過敏性哮喘患者中表達下降；miR-223 的表達與上述2 個miRNA 相反；而miR-374a、miR-126、miR-145 在上述2 組中的表達，差異無統計學意義［24］。而在另一項針對哮喘兒童的研究［26］中則發現：miR-126 和miR-374a 的表達與肺功能［FEV1 與用力肺活量（forced vital capacity，FVC）之比］呈正相關。上述研究提示年齡水平等生理因素可能影響miRNA 表達與哮喘間的關聯。

衰老是影響miRNA 表達的重要因素，HUAN等［27］對全血中150種的miRNA 的分析結果顯示，近70%的miRNA 與年齡呈負相關；而目前研究大部分在成人中開展，僅有3 項關于兒童和一項在老年人中的研究。除上述提及的關于哮喘兒童肺功能的研究［26］外，一項在2016年開展的研究［19］將95例哮喘患兒分為3 組，分別為40 例未吸入皮質類固醇的哮喘、40 例類固醇敏感型哮喘和15 例類固醇耐受型哮喘，并將80 例健康兒童作為對照。該研究發現血清miRNA-21 在鑒別類固醇敏感型哮喘和類固醇耐受型哮喘方面具有預測價值（AUC 為0.99，特異度86.7%，敏感度97.5%）。針對急性期發作的兒童哮喘患者，研究［20］進一步在哮喘住院患兒（48例）和其他疾病住院患兒（48 例）中展開，其結果表明血清外泌體中miR-7b 的表達可用于鑒別急性發作期和臨床緩解期的兒童哮喘（AUC 為0.801，特異度72.9%，敏感度74.5%）。一項研究同時納入了老年和非老年人群，并對分別對2 個年齡段人群中的哮喘和非哮喘患者miRNA 的表達進行對比［25］；盡管在所有研究對象中，哮喘患者的氣道炎癥水平都高于健康對照組，但miRNA-106a 和miRNA-126a 的表達僅與非老年人群的哮喘控制呈負相關，在老年人群中沒有發現該相關性，再一次提示年齡等生理因素可能影響miRNA的表達，從而影響其對哮喘表型的鑒別效果。未來需要更多針對不同年齡、不同身體健康狀況人群的研究來進一步證實這一觀點。

綜合已有研究可知，部分特定的循環外泌體miRNA 濃度可能與哮喘病情的嚴重程度呈正相關，且miRNA 濃度在哮喘病情穩定時也保持同步穩態。此外，循環外泌體miRNA 還具有鑒別過敏性哮喘和非過敏性哮喘等不同哮喘表型的潛力。但是由于目前該領域研究數量較少，已有研究中大部分的樣本量較少，外泌體提取方案的不同等原因，導致研究結論尚不統一。未來需要更大樣本量的前瞻性研究，并開發更加成熟有效的技術高效地提取miRNA，針對不同哮喘表型和嚴重程度，考慮不同年齡人群的特點，進一步確定循環外泌體miRNA 質與量的變化規律，提供有價值的研究成果以指導臨床應用。

3.3 哮喘藥物治療效果和預后評估

RⅠAL 等［28］的研究中納入了16 例嗜酸粒細胞性哮喘患者，分為瑞利珠單抗治療組（10 例）和美泊利單抗治療組（6 例）進行為期8 周的治療，發現患者血清中的miRNA 在治療后表達水平發生改變，其中miRNA-338-3p 表達水平升高最為顯著，但是在不同治療組間沒有差異。在對健康受試者外周血單核細胞體外試驗中，研究者［13］發現糖皮質激素可抑制miR-155、miR-374a、miR-570-3p 的產生。而另一項研究［24］結合了臨床數據和生物信息學分析手段，發現當哮喘患者吸入糖皮質激素后，在過敏性哮喘患者血清中觀察到miR-155、miR-146a、miR-374a和miR-145 的表達增加；在非過敏性哮喘患者血清中miR-223 和miR-374a 的表達與血液嗜酸粒細胞的水平相關，與是否吸入糖皮質激素無關。隊列研究［23］在基線調查后的6～12 個月對20 例哮喘患者進行隨訪，其結果則提示在治療措施沒有改變、自身病情保持穩定時，miRNA 的表達在一段時間內保持穩定。哮喘藥物治療是否可導致血液中循環miRNA 表達的改變，以及這一變化的幅度，可能受患者自身健康狀況和疾病表型等的影響。但目前該領域研究較少，證據尚不充分，需要未來更多的研究來擴充和證實。

3.4 潛在生物學機制

根據大部分已有研究結果顯示，miRNA 的表達差異參與調節氣道炎癥過程，維持上皮細胞穩態和氣道重塑［29］；并且與肺功能呈負相關［16，18，24］，與炎癥指標如嗜酸性粒細胞［16，19］、中性粒細胞［16］、血清ⅠgE 和CRP［15］、促炎細胞因子［20］、ⅠL-4［20］呈正相關。

miRNA 參與了T 淋巴細胞和氣道結構細胞（如氣道平滑肌細胞、氣道上皮細胞）之間的通信，T 細胞的激活誘導miRNA 的產生和分泌，這些miRNA 被氣道結構細胞吸收導致嗜酸性粒細胞增多和肺部炎癥［30］。循環外泌體miRNA 還調控哮喘的重要信號通路［28］。例如，miR-223 靶向胰島素樣生長因子-1 受體（insulin-like growth factor-1 receptor，ⅠGF-1R）、Ras/絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK） 和 磷 脂 酰 肌 醇 3 激 酶（phosphoinositide 3-kinase， PⅠ3K）/蛋白激酶 B（protein kinase B，PKB/Akt）信號通路，促進肥大細胞凋亡［31］。miR-125b 可以抑制p53 的表達，而p53是參與細胞增殖的關鍵調節因子，也參與線粒體生物合成［32-33］。p53通過激活p21和Bax的轉錄（其中p21能阻斷細胞周期，Bax 誘導細胞凋亡），抑制氣道上皮細胞增殖并促使其凋亡［34］。miR-21 被認為是在哮喘的動物體內和人體氣道平滑肌細胞中上調幅度最為顯著的miRNA，在哮喘氣道炎癥和氣道重塑中發揮了重要作用［35］。miR-21 在MAPK 和B 淋巴細胞受體信號通路中抑制PTEN基因（phosphates and tensin homologue deleted on chromosome ten gene，PTENgene）表達并增加Akt 活性，激活mTOR 信號通路的靶點并產生ⅠgE［36］。此外，miR-21 通過靶向ⅠL-12 的p35基因調節Th2 和Th1 的平衡，影響ⅠL-12/γ 干擾素（interferon-γ，ⅠNF-γ）促炎通路，或通過抑制Toll 樣受體2（toll-like receptor 2，TLR2）信號通路調節肺部炎癥反應［35］。另外，miR-21 可通過PTEN 通路，激活PⅠ3K/Akt 信號級聯反應，誘導細胞增殖和遷移，在哮喘氣道重塑中發揮重要作用［37］。因此，在哮喘的發病機制中，miR-21 的功能與抗炎、類固醇不敏感和氣道重塑相關。類固醇是一類有效的抗炎藥物，參與轉錄因子調節過程，如誘導核轉錄因子-κB（nuclear factor-kappa B， NF- κB） 和激活蛋白1（activator protein 1，AP-1）［38］。而miR-21 受NF-κB和AP-1 的調控，兩者通過與miRNA 啟動子結合激活miRNA 轉錄并增強其表達，可部分解釋miRNA 在不同類固醇耐受型哮喘患者中的表達差異［39-40］。但其中機制尚未完全闡明，還可能受到年齡、自身健康狀況等因素的影響［24，27］。

4 總結與展望

在哮喘的臨床診斷、病情嚴重程度和表型判斷、療效和預后評估領域，對特異性循環外泌體miRNA表達的差異和變化的探究是一個新穎且具有前景的方向。然而，由于外泌體研究的臨床起步較晚，目前仍然面臨著許多問題與挑戰。基于上述論述，可以總結出以下2 點：①既往研究中差異化表達的miRNA 種類尚不一致，主要涉及miR-21［14，17，19］和miR-125［15，22］。多種循環外泌體miRNA 可能協調作用于哮喘發生與發展，且一些與哮喘相關的miRNA 似乎具有相同的功能，但各研究結果不一致，無法得出統一結論。②目前報道的大部分研究樣本量較小，且絕大部分在成人中進行，沒有考慮到特殊人群不同的生理特征差異。另外，雖然不少研究對循環外泌體miRNA 在哮喘病理機制中的作用進行了初步研究，但miRNA 的組織或細胞來源、運輸方式與途徑、以及靶細胞尚不清楚。循環外泌體miRNA 的靶向特異性較差，這可能導致miRNA 在實際治療過程中出現脫靶等情況。并且缺乏統一的提取方案，提取出的循環外泌體miRNA 含量少，檢測難度大、成本高。

目前，該領域僅有的相關基礎研究，提示循環外泌體miRNA 在哮喘疾病的診斷、病情嚴重程度和表型鑒別以及治療效果的評估等方面都可能發揮著重要的作用，但將研究結果轉化應用于臨床仍有較大的距離。希望未來研究的不斷深入與發展，為哮喘的診斷和表型鑒別提供安全、便利、靈敏的早期生物標志物，為哮喘治療以及預后評估提供可靠、可行的靶向性策略。