近視相關非編碼RNA的研究進展

陳威存，苑 影，柯碧蓮

上海交通大學醫學院附屬第一人民醫院眼科，上海 200080

在人類基因組中，非編碼RNA （non-coding RNA，ncRNA） 是一類不具有蛋白質編碼功能的RNA，主要包括微RNA（microRNA，miRNA）、長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）、環狀RNA（circular RNA，circRNA），可參與機體的生長發育、免疫反應、腫瘤形成等多種病理生理過程。研究發現，非編碼RNA 能在多個生物水平調控基因表達、細胞分化、細胞增殖、感染及免疫應答。其中， miRNA 能夠與信使RNA （message RNA，mRNA）結合并誘導其沉默降解，進而限制基因轉錄之后的表達。lncRNA 組織特異性高，屬一類多功能調節分子，雖然lncRNA相較于miRNA序列保守性較低，但具有不同層面的調節功能。lncRNA 調控主要分為4 個層次：①表觀遺傳學修飾。lncRNA 能夠改變DNA/RNA 甲基化狀態、染色體結構從而控制基因表達。②轉錄調控。lncRNA 能與轉錄因子結合從而控制基因轉錄活性。③參與mRNA 轉錄后調控過程。例如RNA 編輯、蛋白翻譯、可變剪切。④控制miRNA 從而影響mRNA 表達。lncRNA 亦可與mRNA競爭性結合miRNA（海綿作用），阻止miRNA 與靶基因結合［1］。circRNA 除了高度組織特異性以外，由于共價環結構維持其高穩定性，是一類具有生物醫學潛力的非編碼RNA［2］。

近視是一種眼球過度發育性疾病，當眼軸延長時，遠處的平行光線無法聚焦于視網膜上，導致患者視遠不清。我國是近視大國，近視的發病率過去20年間上升了約20%，且近年來呈現高度化趨勢，我國將面臨嚴重的公共衛生挑戰［3］。SUN 等［4］發現，大學生近視患病率為95.5%，其中高度近視占19.5%。東亞、東南亞地區近視患病情況尤為嚴重，據調查［5］，青壯年近視人數占80%～90%，高度近視的患病率則高達10%～20%。一項全球性的報道［6］中預測，全球近視人口在2050 年將達到總人口數一半，其中10%為高度近視人群。而高度近視容易伴發可威脅視覺功能的并發癥［7］，如視網膜脫離、青光眼、黃斑脈絡膜變性等［8］。目前，臨床上對于近視的矯正多采用配戴眼鏡或屈光手術等對癥治療的方法，對于近視病因的研究是臨床亟待解決的難點和重點問題［9］。近視發病的經典研究認為，近視過程中，視覺信號作用于視網膜色素上皮細胞或視網膜細胞，刺激并釋放一些細胞因子［10］，進而傳導至鞏膜組織，導致細胞外基質重塑、膠原降解及鞏膜變薄，最終導致眼球延長，近視發生發展［11］。大多數學者認為，近視是環境因素和遺傳因素互相作用的一類疾病。因此探究近視基因的表達、修飾以及各種RNA 系統的改變顯得尤為重要［12］。

近年非編碼RNA 在近視研究中受到越來越多學者們的關注。基于測序技術及生物信息學的快速發展，與近視相關的復雜調控及代謝通路的研究得到了長足的發展。因此，本篇綜述總結了與近視相關的非編碼RNA 研究進展，及其在近視發病機制中的潛在作用，以期提供更多防控近視的干預靶點和思路。

1 miRNA與近視

miRNA 是一類長度約22 個核苷酸的單鏈非編碼RNA，大部分具有高度保守性。成熟的miRNA 識別并結合靶向mRNA 非編碼區（3'-UTR），促進目標mRNA 降解或抑制mRNA 翻譯，從而調控基因表達［13-15］。大量研究證實miRNA 廣泛參與細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡、細胞代謝等各種細胞生物學活動［16］。近年來，研究發現miRNA 與近視密切相關，基于miRNA 表達譜與基因表達調控的相關研究，可能為延緩近視進展提供一條重要線索。下文以視網膜和鞏膜為靶組織描述近視發生發展的分子生物學機制。

1.1 miRNA調控近視鞏膜重塑的作用

METLAPALLY 等［17］首次應用miRNA 表達譜技術分析鞏膜的發育情況。通過比較成人與胎兒（24周）鞏膜組織的miRNA，探索差異表達的miRNA 與膠原調節、細胞外基質重塑之間的關聯，從而尋找影響眼球生長發育的 miRNA。 定量反轉錄 PCR（quantitative reverse transcription PCR，qRT-PCR）結果證實，胎兒鞏膜周邊部與后級部組織中miR-214、let-7e、miR-103、miR-107、miR-98 表達顯著上調，而let-7b 和let-7c 僅在成人和胎兒后極部表達有差異。根據胎兒鞏膜處于快速成長期，可能與近視發展時鞏膜生長的過程類似，因此推測胎兒鞏膜差異表達發現的miRNA 可能與近視時膠原蛋白代謝、鞏膜重塑密切相關。

為了探索miRNA對近視鞏膜重塑的作用及機制，TANAKA 等［18］應用負透鏡誘導的近視（lens induced myopia，LⅠM） 小鼠模型，對鞏膜進行miRNA 微陣列分析發現：與對照組相比，近視小鼠鞏膜檢測出大量差異表達miRNA，其中30 個miRNA上調，40 個miRNA 下調。此外，與眼內其他組織間差異表達miRNA 關聯性分析發現：mmu-miR-7047-3p、mmu-miR-7085-3p 和mmu-miR-96-5p 在眼前節及后節組織樣本中顯著高表達。GUO 等［19］為了深入研究鞏膜重塑在近視發展過程中的機制，對LⅠM的豚鼠鞏膜組織進行高通量測序分析，鑒定出27 個差異表達miRNA，這些miRNA 與過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptor，PPAR）信號、丙酮酸和丙酸乙酯代謝以及轉化生長因子-β （transforming growth factor-β，TGF-β）等信號通路有密切關聯。研究［19］表明，上調的rno-miR-19b-3p 可能是過氧化物酶體增殖物激活受體α （peroxisome proliferators-activated receptor-α，PPAR-α）潛在的直接調節器，而PPAR-α 已被證實在LⅠM 豚鼠鞏膜組織表達下調。針對鞏膜組織在不同近視動物模型的高通量分析，獲得許多可能在近視發展過程中起調節作用的miRNA 及可能的代謝通路，但其具體機制仍待確認。

1.2 近視視網膜miRNA 的表達及其調控機制

METLAPALLY 等［20］對形覺剝奪性近視（form deprived myopia， FDM）小鼠進行miRNA 與mRNA差異表達分析發現，54 個miRNA 和261 個mRNA 呈現差異表達。后續實驗證實在FDM 小鼠模型中let-7a顯著下調，miR-16-2 顯著上調。此外，3 個候選mRNA 靶基因Smok4a、Prph2和Gnat1可作用于近視時鞏膜細胞的調控。TKATCHENKO 等［21］研究FDM 10 d 的小鼠視網膜miRNA 表達譜，共發現53 個差異表達miRNA，其中37 個上調，16 個下調。經過ⅠPA基因交互網絡軟件分析，發現其中9個mRNA 與神經形成的相關信號通路有所重疊。MEⅠ等［22］收集FDM 34 d 小鼠模型的眼組織，以微陣列的數據結果分析發現，視網膜組織中獲得24個差異表達miRNA，其中2 個miRNA（miR-466h-5p 與miR-466j）富集于突觸傳遞的相關生物過程中，如軸突引導和TGF-β信號通路。LⅠU 等［23］通過FDM 近視小鼠的miRNA表達譜分析進行全面的生物信息學分析，以尋找近視相關miRNA；該研究將GSE58124 和GSE84220 這2 個原始微陣列數據集信息進行合并，觀察到mmumiR-1936、mmu-miR-338-5p 和mmu-miR-673-3p 3 個與近視顯著相關的上調miRNA，靶基因主要為富集在視網膜組織的發育和泛素化結合相關的基因。此外， 前2 個miRNA 在定量聚合酶鏈反應（quantitative PCR，qPCR）實驗驗證也觀察到差異具有統計學意義。因此，根據結果可知，mmu-miR-1936、mmu-miR-338-5p 和mmu-miR-673-3p 上調可能與近視發展過程中的調控有關。根據不同動物近視模型視網膜組織的miRNA 研究分析，確定了對照組與近視組表達差異的miRNA，提供更多近視潛在的生物標志物。可見，視網膜組織細胞中也包括許多調節近視的差異表達miRNA，但需等待更進一步的功能試驗驗證與近視發展機制的關系。

1.3 miRNA與相應靶基因調節近視發展

miR-29a 具有調節細胞外基質的功能，被認為是治療近視的一個潛在靶標。研究證實，miR-29a 與Ⅰ型膠原蛋白α1 鏈（collagen type Ⅰα1，COL1A1）和基質金屬蛋白酶2 （matrix metallopeptidase 2，MMP2）的表達密切相關。近視模型研究證實，鞏膜組織中COL1A1表達減少，MMP2表達增加［24-26］。XⅠE 等［27］研究發現，miR-29a 可靶向COL1A1基因，使位于單核苷酸位點rs157907 的G 等位基因產生突變，從而降低近視風險。ZHANG 等［28］過表達RPE細胞和人類鞏膜成纖維細胞的miR-29a 發現，近視相關基因MMP2表達受到抑制。WANG 等［29］證明京尼平藥物能夠抑制豚鼠近視模型miR-29 簇和MMP2基因，促進COL1A1在鞏膜組織的表達，可作為近視的一種干預策略。ZHU 等［30］的研究結果顯示近視組miR-29a 表達水平顯著高于對照組；該團隊以高通量測序的方法鑒定高度近視患者房水的miRNA表達譜，研究提取高度近視患者與對照組白內障患者的房水進行比對，找出262 個miRNA 表達上調，5 個表達下調，其中包括17 個新發現的miRNA，通過qPCR 驗證高度近視患者的hsa-let-7i-5p、hsa-miR-127-3p 和hsa-miR-98-5p 的表達具有潛在意義。進一步分析研究［31］發現，miR-29a 在高度近視患者的房水和血漿有更高的表達水平。調控機制方面，miR-29a 能夠抑制人成纖維細胞的Ⅰ型膠原蛋白合成，可作為調節近視發育的生物標志物進行進一步研究。此外，miR-29a 除了在近視模型中調控細胞外基質，也可在近視患者房水靶組織中起調控作用。

研究表明，miR-328 與近視相關基因PAX6（paired box 6）、MMP2、HOXA9（homeobox A9）有關聯［26，32-34］。CHEN 等［35］證實，miR-328 與PAX6基因在人類RPE 細胞和鞏膜成纖維細胞都有顯著表達。LⅠANG 等［36］研究表明PAX6的單核苷酸位點rs662702 可能與miR-328 結合調節近視發展。當miR-328 結合rs662702 的C 等位基因，會負向調節靶基因PAX6，并增加MMP2的表達。同時，視黃酸會根據劑量依賴性地增加miRNA-328 的表達，進而抑制PAX6的表達。根據先前文獻報道［37-38］，視黃酸反應組件位于miRNA-328 啟動子中，可能在FDM 模型的代謝變化中發揮作用。KUNCEVⅠCⅠENE 等［39］檢測近視患者外周血樣本發現，miR-328 表達顯著上調，但是miR-328與PAX6基因（rs662702）多態性之間的關聯未被證實。LⅠANG等［40］研究發現上調人類及小鼠原代RPE 細胞miR-328 水平，HOXA9表達亦增加，PAX6基因水平則被抑制。KUNCEVⅠCⅠENE 等［41］通過外周血樣本以及眼底照相分析RPE 細胞的光密度與miR-328 和PAX6基因（rs662702）多態性的關系。結果表明，近視患者會隨著血液中miR-328 的上升，RPE細胞的光密度顯著減低，但是rs662702單核苷酸基因型變體與RPE 細胞的光密度無顯著關聯。miR-328 的調控機制可以解釋近視者和健康者之間，各個組織細胞分子不同的調節作用。

2 lncRNA與近視

lncRNA 是大于200 個核苷酸的非編碼轉錄物質，一般存在于細胞核和細胞質內，多數不具備編碼翻譯功能，但少量lncRNA 能編碼小蛋白參與生物過程［42］。根據基因組上的特定位置可將lncRNA 分為5 種類別，分別是反義、有義、雙向、內含子和基因間RNA［43］。許多研究證實lncRNA 是控制細胞分化、細胞周期、基因組完整性的關鍵分子［44］。lncRNA 在眼腫瘤、青光眼、白內障、視網膜等眼部疾病均有研究報道［45］。近年來，lncRNA 調控近視的作用受到學者的關注。GENG 等［46］對FDM 和LⅠM 的豚鼠視網膜、脈絡膜及鞏膜樣本，采用高通量RNA 測序分析，結果顯示：FDM 組有228 個lncRNA 上調，144 個lncRNA 下調；LⅠM 組則有119 個lncRNA 上調和128 個lncRNA 下調。這些差異表達的lncRNA 中，只有68 個在2 種近視模型中呈現出共同的趨勢。經與qPCR 驗證lncRNA 表達，相比于對照組，FDM 組和LⅠM 組lnc000906 和lnc000049 這2 個lncRNA 的表達皆上調；相反地，lnc0031538 和lnc002905 的表達則下調。此外，2 組近視模型（FDM 組vsLⅠM 組）之間的lnc0031538和rna39119表達有差異。進一步采用基因功能聚類分析發現，異常表達的lncRNA 可調節細胞外基質成分，并參與激酶活性、新陳代謝等生物學過程，也可能參與調控細胞外基質的糖胺聚糖降解和黏蛋白型O-聚糖生物合成的過程。因此，lncRNA可能通過參與細胞外基質成分調控信號通路控制近視的發生，但其具體機制仍不明確。

3 circRNA與近視

circRNA 是一種具共價閉環結構的RNA，通過mRNA 反向剪接下游5′端位點與上游3′端位點連接所形成的單鏈閉環，因此不具備5′端至3′端極性和3′端聚腺苷酸化末端。circRNA 與線性RNA 相比表達水平更加穩定，具備更好的穩定性和保守性［47-48］。由于其高度穩定性和組織特異性，有望應用于疾病治療［49］。生物學功能方面，circRNA 具有類似于lncRNA 的miRNA 海綿效應，可通過競爭性結合內源性RNA，影響miRNA 介導的后續調節機制［50］。作為新型的非編碼RNA， circRNA 在近視中的作用備受關注。近視發展過程中，脈絡膜厚度變薄，脈絡膜血流減少，這可能是導致鞏膜缺氧重塑的原因［51-52］。LⅠ等［53］在FDM 模型中，觀察到circRNA-FoxO1 的水平在脈絡膜組織中顯著上調。為了明確circRNAFoxO1對于脈絡膜的作用，進一步通過體外細胞實驗證實，抑制circRNA-FoxO1可降低脈絡膜內皮細胞的增殖、遷移和血管形成能力。體內實驗研究發現，沉默circRNA-FoxO1能夠減緩豚鼠眼軸延長和玻璃體長度增加。此外，circRNA-FoxO1 過表達可抑制miR-145，并誘導VEGFA 和ANGPT2 水平升高。熒光素酶實驗證實，VEGFA/ANGPT2是miR-145 的目標基因。因此，該研究證實并總結circFoxO1-miR-145-VEGFA/ANGPT2 通路參與調節脈絡膜血管功能，調控近視的發展。

4 結語與展望

隨著與近視相關的非編碼RNA 研究的深入，我們對于近視的機制研究有了全新的認識，其中miR-328、miR-29a、circRNA-FoxO1 都是與近視相關的重要分子。本文全面總結從近視患者與動物近視模型篩選出的miRNA、lncRNA 及circRNA，試圖闡明非編碼RNA 與近視的潛在關聯。miRNA 作為非編碼RNA家族的重要一員，描述大量miRNA與近視研究相關，但是調節機制作用待后續實驗驗證；目前已知由miR-328 介導的PAX6基因下調與高度近視相關聯，在近視形成過程發揮重要調控作用；miR-29a 在細胞外基質中具有分子調控功能，作用于MMP2和COL1A1基因，影響鞏膜成纖維細胞的表達；circRNA 可以通過與miRNA 相互作用以調控后續信號通路。circRNA-FoxO1 在脈絡膜血管血流方面具有重要作用，受到抑制時血流增加，緩解眼軸生長的速度；其過表達時則可抑制miR-145 的表達，增加近視發生的機會。然而其他circRNA 與近視相關的研究結果甚少。lncRNA 和circRNA 在近視領域都處于起步的階段，不管是近視模型或病例組織樣本的高通量篩選，或是非編碼小分子于疾病的功能調節，現今仍有許多近視相關分子能夠被挖掘或應用。

目前，因為近視患者的視網膜、鞏膜臨床樣本難以獲得，僅有少部分文獻觀察近視患者的房水中細胞因子水平的變化，非編碼RNA 分子研究調控機制探索和臨床治療干預試驗更是少數。因此，未來如果可能有更多的靶器官樣本的研究，或結合近視的基因學和外周血的研究，探索非編碼RNA 于鞏膜重塑過程或脈絡膜血管血流的調控，將有助于從近視人群中尋找重要的分子機制，為近視的干預治療提供全新的思路。