分子印跡技術在四環素類抗生素處理中的應用進展

馬煜萱，李靖，許愿，郭冀峰

(長安大學 水利與環境學院 旱區水文與生態效應教育部重點實驗室，陜西 西安 710054)

四環素是一類廣譜抗生素的統稱，其中包括四環素、金霉素、土霉素、半環素、甲環素、替加環素等[1]。自1940年四環素被發現以來，被廣泛應用到獸醫學、醫學、畜牧業等方面[2]。據研究報道，超過70%的四環素會通過人類和動物的糞便尿液排入環境中，最終造成地表水和地下水的污染[3]。此外，過量的四環素會抑制水生生物的生長，促進抗生素耐藥性細菌的生長，對人類健康和環境造成嚴重威脅。四環素的降解和檢測對于凈化水體，保護生態環境具有重要意義。然而，環境中殘留的四環素通常具有低濃度、高污染、基質復雜等特點。如何快速的選擇性的識別并檢測四環素成為降解四環素的重要環節。

分子印跡是一種具有特異性，選擇性識別目標分子的新型技術，其最大的特點是特異性識別污染物。因此利用分子印跡技術去除和監測復雜環境和食品中的痕量污染物受到了廣泛的關注。2004年Cai等[4]首次將四環素作為模板分子合成印跡聚合物，用于選擇性吸附四環素。2018年，Mohsenzadeh等[5]總結了分子印跡聚合物在測定牛奶中抗生素的應用；2020年，王莉燕[6]課題組綜述了分子印跡聚合物在抗生素殘留測定中的應用。目前還未有關于分子印跡技術處理四環素類抗生素的綜述，本文系統總結了近年來分子印跡技術在處理食品和廢水中的四環素的應用進展，包括分子印跡固相萃取技術和分子印跡傳感器提取和監測食品中的四環素，以及分子印跡與光催化、膜分離技術結合處理廢水中四環素。

1 分子印跡技術在提取和檢測食品中四環素的應用

1.1 分子印跡固相萃取技術

四環素因抗菌性好、實用性強、價格低廉被廣泛運用到畜牧業和獸醫學中，然而，四環素的過量使用會導致動物源性食品存在殘留的微量四環素，對人類健康產生極大威脅。目前應用最多的檢測方法為高效液相色譜法(HPLC)。但大多數食物樣品中的四環素濃度較低且樣品基質成分復雜，檢測其殘留四環素前必須經過提純預處理，固相萃取是最常見的樣品預處理技術。但固相萃取技術容易受到雜質干擾，且有機溶劑消耗量大，選擇性低。將分子印跡技術與固相萃取技術結合，以印跡聚合物作為萃取吸附劑，相比與傳統固相萃取法，具有可選擇性高、識別性強、結果靈敏準確等優點。目前，國內外已有利用分子印跡聚合物作為固相萃取劑的許多研究性報道。Wang等[7]合成了一種新型混合模板分子印跡聚合物，建立了基質固相分散法同時提取豬肉中的4類四環素類藥物，并進行超高效液相色譜測定。該方法對豬肉中四環素的檢出限在0.5～3.0 ng/g之間，可作為一種快速、簡便、特異、靈敏的肉類中藥物殘留的多組分檢測方法。Xu等[8]以牛血清白蛋白(BSA)和多巴胺為雙功能單體制備了新型磁性分子印跡納米材料，將印跡納米材料作為固相吸附劑，與高效液相色譜相結合，選擇性地從未處理的牛奶樣品中提取并測定痕量四環素。四環素類藥物的回收率在84.1%～95.8%之間，相對標準差<6.7%。Feng等[9]以四環素為模板分子，甲基丙烯酸為功能單體合成了分子印跡聚合物。制備的固相萃取柱能同時捕獲4個四環素，吸附能力高(3 560～4 700 ng)，回收率高(>87%)，檢出限在20～40 ng/g范圍內，強化空白樣品(牛奶、雞蛋和豬肉)的回收率在74%～93%范圍內。He[10]以氧化石墨烯(GO)和碳納米管(CNT)的三維碳納米復合物合成了選擇性高的親水性四環素印跡聚合物，以該聚合物作為吸附劑固相萃取食品中的TC殘留物，然后通過高效液相色譜(HPLC)檢測。在最佳條件下，該方法的檢出限(MDL)為0.127 μg/kg。該方法的提取效率是在三個真實樣品(牛奶、雞肉和魚類)中進行的，這些樣品中摻入了3個水平(5，10，20 μg/kg)的四環素。結果顯示回收率分別為(85.58±0.19)%～(116.87±8.92)%(S/N=3)。Ma等[11]將二甲胺四環素分子印跡納米聚合物聚合在金屬有機骨架材料表面，合成一種新型復合材料。以該化合物為吸附劑，建立了分散固相微萃取雞肉中7種四環素的超高效液相色譜測定方法。該復合材料對7種四環素具有較高的吸收能力(2 200～3 000 ng/mg)和高回收率(>92%)，可重復使用8次。7種藥物的檢出限為0.2～0.6 ng/g，該方法可作為肉類中四環素殘留量多重檢測的實用工具。

1.2 分子印跡傳感器

傳統檢測四環素的方法有：高效液相色譜法、液相色譜-質譜聯用、毛細管電泳、酶聯免疫吸附實驗等[12-15]。傳統方法雖然檢測效果好，但存在耗時長、儀器昂貴、操作復雜、樣品需預處理等缺點。因此亟待開發一種操作簡單、方便、選擇性高的方法檢測四環素。分子印跡傳感器的出現很好地解決了傳統檢測方法選擇性差的問題，受到了國內外許多研究人員的青睞。分子印跡傳感器可分為兩大類：光學傳感器和電化學傳感器。其中光學傳感器包括光子晶體傳感器和熒光傳感器。分子印跡光子晶體傳感器是一種快速、簡單、可視化識別目標污染物的傳感器；熒光傳感器由于具有檢測步驟簡單、靈敏度高等優良特性，被廣泛應用于TC的檢測。電化學傳感器與光學傳感器相比，檢測范圍更廣。

1.2.1 分子印跡電化學傳感器檢測四環素 電化學傳感器是通過將分析物與電極表面受體之間相互作用產生的化學信息轉化為可分析測量的信號來對目標分子進行定量分析的一類傳感器。目前，分子印跡電化學傳感器的一個發展趨勢為將MIPs與納米顆粒結合修飾電極，增強分析物識別能力和傳質效率，從而提高傳感器的靈敏度。常見的納米材料有：石墨烯、碳納米管、AuNPs等。Devkota等[16]以分子印跡過氧化聚吡啶(MIOPPy)修飾的絲網印刷碳電極(SPCE)和金納米顆粒(AuNPs)為基底，研制了一種檢測四環素(TC)的選擇性、靈敏度高的電化學傳感器。在優化條件下，校準曲線呈1～20 mol/dm3的線性趨勢，檢出限為0.65 mol/dm3。該傳感器成功地用于測定真實食品樣品中的TC，回收率為63%，高于90%，與LC-MS法相當。Bougrini等[17]基于分子印跡聚合物和金屬有機骨架修飾的金電極制備了電化學傳感器。該傳感器的線性范圍為2.24×10-13～2.24×10-8mol/dm3，檢測限低至2.2×10-16mol/dm3。該方法成功地用于蜂蜜中四環素的測定。四環素的回收率為101.8%～106.0%，RSD為8.3%。目前，一種新興材料二維COF材料在開發快速、方便、高導電性材料方面有著廣闊的前景。高度有序的多孔結構和金屬活性位點的存在使得制備的二維COF具有良好的導電性和電催化活性，從而提高了所構建傳感器的靈敏度。Ma等[18]以o-PD為功能單體，TC為分子模板，在COF修飾電極表面電聚合制備分子印跡電化學傳感器。該傳感器在5×10-13～6×10-12mol/dm3的濃度范圍內與四環素呈良好的線性關系，檢出限為2.3×10-13mol/dm3。為四環素在食品中的檢測提供了一個經濟、靈敏、特異性強的可行平臺。

1.2.2 分子印跡熒光傳感器檢測四環素 熒光傳感器是一種可以將被檢測物質的濃度轉化為熒光信號的傳感器材料，具有靈敏度高、操作簡單、檢測速度快等優點，在抗生素檢測尤其是四環素檢測中越來越受歡迎。分子印跡熒光傳感器不僅具有熒光分析的高靈敏度，同時也具有MIPs的高選擇性。以量子點作為熒光材料制備分子印跡傳感器較為常見。TC不存在時，量子點和印跡聚合物的電子在接受紫外光子時從價帶被激發到導帶，隨后被激發的電子回到價帶，產生熒光信號。相反，若TC存在，TC的羥基與量子點的氨基之間存在氫鍵作用，強相互作用使得量子點與TC之間的電子發生轉移，量子點的能量會轉移到QD/MIP和TC的復合物上，導致其熒光猝滅，不產生熒光信號。通過量子點的熒光變化(猝滅或增強)對四環素濃度進行定量估計。與傳統量子點相比，碳量子點具有安全無毒、熒光效果好、穩定性強等優點，因此越來越多地被應用于食品中四環素的檢測。Zhou等[19]通過結合分子印跡聚合物(MIPs)和石墨烯量子點(GQDs)開發了一種新型熒光傳感器，在最佳條件下，其線性范圍為 1.0～104μg/L 和檢出限確定為1 μg/L。GQDs-MIP也表現出對TC的高選擇性。熒光傳感器成功應用于實際牛奶中TC的檢測。Wang等[20]成功制備了SiO2-AF@MIPs熒光表面印跡傳感器檢測四環素，SiO2-AF@MIPs傳感器表現出較高的靈敏度(LOD低至4.26 ×10-9mol/dm3)、快速檢測率、可重復使用性能和較好選擇性。Wei等[21]制備了一種新型碳量子點分子印跡熒光傳感器用來檢測四環素，其線性范圍為1.0～60 mol/L，檢出限為 0.17 mol/L。這種新型熒光傳感器可以成功地用于實際樣品中四環素的檢測。為四環素在復雜環境中的選擇性識別和快速檢測提供了一種新思路。Hou等[22]將印跡聚合物接枝到碳量子點表面，采用微波輔助制備熒光印跡復合材料檢測牛奶中的四環素，隨著四環素濃度從2×10-8mol/dm3增加到 1.4×10-5mol/dm3，復合材料的相對熒光強度呈線性下降。其檢出限為5.48×10-9mol/dm3。Li等[23]制備了嵌入碳點(HMIP@CD)的單孔空心分子印跡聚合物，用于檢測蜂蜜中的TC，該傳感器在10～200 μg/L 表現出一個優秀的線性關系，檢出限低至3.1 μg/L。在TC的3個峰值水平下，回收率93%～105%，準確度低于1.6%。該方法為利用熒光干擾檢測復雜基質中分析物提供了一種有效的方法。

1.2.3 分子印跡光子晶體傳感器檢測四環素 光子晶體是一類遵循布拉格衍射定律的具有周期性結構的光子納米材料。分子印跡光子晶體(MIPC)傳感器是一種結合光子晶體和分子印跡的傳感器，在利用MIPC檢測四環素時，分子印跡光子晶體因膨脹或收縮改變了其顆粒間距，最終導致衍射峰波長和顏色發生周期性的變化[24]。通過觀察Debye衍射環在單色激光照射下直徑的變化來檢測MIPC在TC水溶液中的響應性能。 Wang等[25]采用TC作為印跡模板，成功制備了具有特定結合位點的MIPCH傳感器。隨著TC濃度從0增加到60 mol/L，MIPC傳感器的結構顏色由藍變紅。此外，該傳感器也可實現對牛奶中TC的檢測，隨著牛奶樣品中TC藥濃度的增加，MIPC傳感器的顆粒間距增大約92 nm，MIPC的結構顏色由藍色變為綠色變為橙色。然而，MIPC因濕潤性差可能會導致四環素富集，從而影響檢測效果。Hou等[26]通過將MIP-PC比色傳感器與富集工藝相結合，制備了具有親水-疏水模式的高靈敏度比色傳感器，以提高四環素檢測的靈敏度。該MIP-PC比色傳感器可以實現大于200 nm的由青色到紅色的比色轉換，此外，通過將探測區域(MIP-PC dot)的直徑從1.35 mm改變為2.79 mm，該傳感器的探測范圍可以從1×10-8～6×10-8m改變為1×10-8～1.5×10-7m。將10個小滴濃縮成直徑為 1.35 mm 的MIP-PC點，其檢測極限可降至2×10-9m。Han等[27]制備了一種用于食品中四環素檢測的二維分子印跡光子晶體(MIPC)傳感器。以聚苯乙烯二維光子晶體(2D-pcs)為模板，四環素為模板分子，丙烯酰胺為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯劑，采用熱聚合法制備了MIPCs。利用所制備的MIPC傳感器通過德拜衍射環的視覺變化來檢測四環素(TC)。該傳感器響應時間 <10 min。在5次循環使用后仍保持較高的靈敏度，在豬肉和牛奶樣品中TC的回收率分別為 88.4% 和91.0%，也可用于豬肉和牛奶樣品中TC殘留的分析。

2 分子印跡技術在廢水中四環素的應用

2.1 分子印跡光催化技術

光催化技術由于其具有高效性、化學穩定性、綠色性等優點已經被廣泛運用于降解環境中殘量的抗生素[28-30]。在光催化過程中，污染物首先吸附在催化劑表面的活性位點上，催化劑在可見光的照射下產生強氧化性的自由基，將抗生素氧化降解[31]。然而在實際處理過程中，廢水中污染物成分復雜，四環素通常是以痕量形式存在，催化劑中的主要活性物質在降解污染物時并不具有選擇性，因此很難在處理痕量和混合污染物時具有良好的效果。印跡催化復合材料相較于單一催化材料，不但可以提高催化劑的特異識別能力，同時印跡聚合物可為催化劑提供活性位點，增強其降解效率。

Sun等[32]制備了一種分子印跡Ag/Ag3VO4/g-C3N4光催化劑(MIP)，具有良好的特異性識別能力和光催化活性，MIP的k值最高(0.017 94 min-1)，比原始CN、Ag3VO4、Ag/Ag3VO4/CN和NIP分別高 6.62，1.80，1.12和1.30倍。Du等[33]以四環素(TC)為分子模板，合成了一種簡單、可循環利用的印跡催化復合材料ZnO@NH2-UiO-66(ZUM)，在可見光照射下，ZUM在30 min內可降解61.9%的四環素。Lu[34]采用光聚合方法和表面印跡技術合成了環保型MFA型異質結印跡光催化劑(PPy@CdS@MFA印跡)，PPy@CdS@MFA印跡光催化劑對四環素的降解率(77.59%)是環丙沙星印跡光催化劑(34.57%)的2倍多，PPy@CdS@MFA印跡光催化劑相對于CdS、CdS@MFA和非印跡光催化劑的選擇性系數(k)分別為0.71，1.79和1.69。Peng[35]采用微波聚合和表面印跡技術合成了磁性粉煤灰表面印跡無金屬異質結光催化劑PGM-SIP，PGM-SIP的SBET高達 43.050 2 m2/g。PGM-SIP相對于g-C3N4@MFA、PPy@g-C3N4@MFA和非印跡光催化劑的選擇性系數分別為1.587，1.756和2.580。Lu等[36]采用微波聚合和表面印跡技術合成了Z型 ZnFe2O4/Ag/PEDOT，Z型ZnFe2O4/Ag/PEDOT的光降解率為71.77%，分別是ZnFe2O4、Ag/PEDOT、非印跡ZnFe2O4/Ag/PEDOT的4.74，1.42和1.31倍。

2.2 分子印跡膜

在眾多分離污染物的技術中，膜分離是一種成本低、污染小、分離效果好的去除污染物的技術。分子印跡膜是由分子印跡聚合物合成的膜，通過在膜上形成特殊的記憶位點來提高膜的選擇滲透性。目前，通過對有機基底膜改性例如添加無機納米顆粒：TiO2，SiO2，Ag+，活性炭納米顆粒等合成印跡膜分離廢水中的四環素獲得了很好的分離效果。Xing等[37]將多層納米復合材料(Ag/pDA)整合到多孔膜結構中。以四環素(TC)為模板分子，制備分子印跡納米復合膜。吸附量達到15.99 mg/g，選擇通透性性能(ρ)=2∶4。微生物降解實驗結果也表明 S-MINMs 具有良好的生物降解性。Wu等[38]制備雙膜基分子印跡納米復合膜(DLMIMs)。以二氧化硅和活性炭納米顆粒作為載體合成第一個印跡層，通過相變過程后，采用溶膠凝膠聚合法制備第二層TC印跡層。獲得了良好的再結合能力(115.5 mg/g)和選擇性分離系數(>6.5)。Wu等[39]將多層納米復合材料(Ag/pDA)整合到多孔膜結構中。以四環素(TC)為模板分子，通過原位光啟動TRP法制備分子印跡納米復合膜。大大提高了TC的再結合能力(35.41 mg/g)，吸附選擇性和結構穩定性在10次循環操作后仍保持最大吸附能力(92.1%)。

3 結論與展望

四環素的濫用會導致其在環境和食品中富集，對人類的健康帶來潛在威脅。在處理四環素的過程中，分子印跡技術展現出巨大的應用價值。將分子印跡與膜分離、光催化技術結合可大大提高廢水中四環素的分離和降解效率。此外，與傳統檢測方法相比，分子印跡傳感器可實現食品中四環素的快速、高效檢測。分子印跡技術的出現雖然對提取和檢測四環素提供了很大的便利，但同時也存在一些問題，例如：分子印跡膜中印跡位點的引入可能會對膜通量造成影響；分子印跡熒光傳感器的熒光團的壽命較短，無法實現長期檢測。但分子印跡作為一種新興技術，具有獨特優異的性能，在未來仍有巨大的發展潛質。將分子印跡技術與更多新材料(納米材料)、新技術(固相微萃取、基質固相分散萃取)結合，有助于未來實現更加高效、綠色、環保的四環素分析檢測。