DNA甲基化在骨質疏松癥中的研究進展

潘曉豪 周展毅 凌奕清 厲駒 徐濤濤*

1.浙江中醫藥大學第一臨床醫學院，浙江 杭州 310053 2.浙江中醫藥大學附屬第一醫院，浙江 杭州 310006

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量減少、骨脆性增加為特征的全身性代謝性骨骼疾病，常常導致脆性骨折的發生。而OP的發生多由基因和環境因素、飲食習慣、生活方式之間相互作用而引起骨骼重塑失調所致。骨形成與吸收的平衡和維持骨重塑中骨穩態密切相關[1]。在成人骨骼中，骨形成與吸收主要依賴于間充質成骨細胞系和造血破骨細胞系兩者的相互作用、分化及其相應的功能。由于成骨細胞(osteoblast，OB)和破骨細胞(osteoclast，OC)的分化、活化和凋亡受到高度調控，能夠使骨重塑保持平衡。一旦調控過程出現異常，往往導致骨穩態失衡。目前，有全基因組關聯研究(genome-wide association studies，GWAS)表明在人類OP和骨質疏松性骨折(osteoporotic fracture，OPF)發生發展過程中存在遺傳變異和DNA甲基化改變[2]。此外，Kemp等[3]通過GWAS分析確定了多個與骨密度(bone mineral density，BMD)相關的基因位點，然而這些位點只能解釋部分骨表型變異(約12%)。

表觀遺傳學是指基于非基因序列改變所致基因表達水平變化，主要包括轉錄后microRNA(miRNA)介導的靶mRNA負調控、DNA甲基化以及組蛋白修飾。DNA甲基化修飾具有高度動態、可逆、年齡相關、細胞和組織特異性的特征，并且對內源性信號和(或)環境刺激敏感。目前，DNA甲基化被認為是通過環境因素和隨機內外源性應激促進OP發生發展的關鍵機制之一。DNA甲基化加強了個體基因組與環境之間的聯系，它能夠影響骨表型和患OP的風險，并與遺傳基因變異協同作用，在一定程度上可以解釋為什么僅靠遺傳因素不足以解釋OP發生發展和脆性骨折易感性的原因。DNA甲基化主要通過對OB、OC、間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的調節引起骨重塑失調，從而促進OP的發生發展。

本文通過綜述DNA甲基化對OB、OC以及MSCs的作用機制，探討將DNA甲基化作為OP診治及預后生物標志物的意義和可能性。

1 DNA甲基化在骨穩態中的影響

DNA甲基化是指在基因組CpG島上胞嘧啶殘基的第5個碳上加上一個甲基的可逆共價加成，通常與基因表達抑制有關。DNA甲基化在調節生物過程和響應外界環境信號中發揮著重要作用。越來越多的研究證明環境因素包括行為、營養、化學物質以及工業污染物等具有表觀遺傳效應。除了遺傳因素外，人的整體健康狀況被認為是多種環境信號的整合，這些信號從妊娠開始并通過表觀遺傳修飾如DNA甲基化發揮作用[4]。一項全基因組研究評估了骨質疏松性髖關節骨折患者股骨頭骨小梁樣本的DNA甲基化圖譜(分析了13463個基因中23367個GpG位點的甲基化)，結果表明，甲基化與全基因表達之間存在負相關關系[5]。DNA甲基化狀態共同調節與骨相關細胞功能有關的各種重要基因表達，如堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、硬化蛋白(sclerostin，SOST)、雌激素受體α(estrogen receptor alpha，ERα)、核因子kB受體活化因子配體(receptor activator of NF-kB ligand，RANKL)、骨保護素(osteoprotegerin，OPG)等[6]。其中RANKL/OPG被認為是調節骨吸收的關鍵因素[7]。

DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferase，DNMT)介導DNA甲基化，催化DNA序列CpG島甲基化，降低基因組穩定性以抑制轉錄活性。DNMT由DNMT1、DNMT3A、DNMT3B組成[8]。DNMT1能夠維持半甲基化DNA的甲基化狀態，DNMT3A和DNMT3B則優先作用于未甲基化和半甲基化的DNA；而TET蛋白(ten-eleven translocation，TET)能夠轉化5-甲基胞嘧啶為5-羥甲基胞嘧啶以誘發DNA脫甲基反應[9]。有研究發現DNMT可參與調控骨形成與骨吸收[10-11]。TET1和TET2用以維持MSCs細胞穩態和骨穩態，TET1和TET2缺失會導致MSCs成骨分化過程缺陷甚至嚴重骨質疏松[12]。

DNA甲基化能夠改變個體的表觀遺傳組成并產生穩定的表觀遺傳效應。通常DNA甲基化通過維持穩定的濃縮染色質構型來建立基因表達抑制狀態[13]。Laurent等[14]研究表明DNA甲基化在DNA復制和有絲分裂過程中得以保留，因此基因組的抑制狀態可以遺傳至子代。這一發現表明，母體DNA甲基化改變對骨穩態的影響可能遺傳至子代。

因此，更好地理解DNA甲基化對骨穩態的影響，并闡明可能的表觀遺傳機制，這將有助于降低老年人骨質疏松和脆性骨折的風險。

1.1 DNA甲基化對成骨細胞的影響

SOST基因的甲基化與絕經后婦女的OPF發生密切相關[15]。SOST基因編碼硬化蛋白，硬化蛋白主要在骨細胞中表達，是一種重要的骨調節劑[16]。硬化蛋白能夠抑制OB活性，同時刺激OC來抑制骨形成[17]。Reppe等[15]實驗表明，硬化蛋白作為Wnt/β-catenin信號調節劑通常在成骨時發揮關鍵作用。在OP患者中，SOST啟動子甲基化增加被認為是一種代償性抵消機制，該機制降低血清硬化蛋白濃度并減輕對Wnt信號傳導的抑制，從而促進骨骼的形成。時宇博等[18]研究結果顯示，絕經后OP患者血漿SOST mRNA相對表達量明顯高于無OP者。與無OP者血漿SOST基因甲基化狀態相比，絕經后OP患者血漿中SOST基因甲基化陽性率低，提示SOST基因甲基化可抑制其mRNA表達。Cao等[19]研究證明OPF患者骨組織中SOST mRNA表達水平與SOST基因甲基化陽性率呈負相關。Delgado-Calle等[20]觀察到，在人股骨骨細胞中，SOST近端啟動子區域呈低甲基化，而在原代OB和骨內膜細胞中則無甲基化，這表明不同細胞類型之間SOST的差異性表達至少部分受到DNA甲基化的調節。因此，SOST基因甲基化可通過阻礙轉錄因子與啟動子的結合影響mRNA表達，降低轉錄水平，這可能是OP發生的機制之一。

眾所周知，雌激素缺乏易導致OP。雌激素通過與ERα結合激活ERα相關信號通路發揮作用。有研究發現SOST啟動子甲基化的改變可影響雌激素與ERα的結合[21]。此外，雌激素能夠通過DNA甲基化增強ERα基因表達，這在一定程度上也影響了雌激素的生物學功能[22]。

骨細胞中的ERα通過調節Wnt拮抗劑表達而在小梁骨形成中起骨保護作用[23]。單獨敲除小鼠OC中的ERα時，小鼠則出現骨小梁區骨量的顯著降低、骨轉換率升高以及OC數量的增多[22]。Rooney等[24]研究集中于特定骨細胞及其前體中靶向缺失ERα的小鼠。成骨祖細胞及前體細胞中缺乏ERα，通常會影響小鼠的骨膜。小鼠分化的OB、OC中缺失ERα，通常會導致骨松質骨量減少，而雌性小鼠通常出現更嚴重的骨量缺陷，提示ERα對骨具有保護作用。此外，Lv等[25]研究證明ERα基因啟動子a區甲基化導致雌激素受體mRNA減少，相比絕經前婦女，絕經后婦女中啟動子甲基化水平增加。Penolazzi等[26]研究人OB中ERα基因遠端啟動子F的甲基化狀態，發現其與OB的生長、分化、活性有密切關系，且ERα基因啟動子F內部CpG位點的甲基化可能直接或間接有助于ERα基因的轉錄控制，從而影響該基因的組織特異性表達。由此可知，DNA甲基化對雌激素及ERα在OP的影響是多途徑的。

1.2 DNA甲基化對破骨細胞的影響

核因子kB受體活化因子(receptor activator of NF-kB，RANK)是OC表面的受體，由骨髓基質細胞、OB兩者合成分泌的RANKL和OPG為RANK的配體，兩者結合可刺激OC分化，促進骨吸收，而OPG與RANK的結合阻斷這種活性[27-29]。OPG/RANKL/RANK作為介導OB與OC相互作用的信號通道，可調控OC的成熟、分化、活性，是最重要的骨代謝信號調節系統之一[30]。因此，該系統的甲基化調節可能在原發性OP發生中起到重要作用[31]。

OC的分化被認為需要RANKL與巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)信號傳導[32]。小鼠ST2細胞去甲基化處理后，RANKL表達顯著增加，說明RANKL啟動子的甲基化水平與其表達水平相關。在高同型半胱氨酸血癥伴OP動物模型中，DNMT1表達增強，使OPG啟動子被高甲基化，OPG轉錄被抑制，從而激活RANKL表達和OC形成，導致骨丟失[33]。Wang等[7]研究證明RANKL和OPG啟動子中CpG位點甲基化水平能夠影響其表達，并且發現與非骨質疏松性骨折的骨組織組相比，RANKL啟動子CpG島中32個CpG位點在OPF組中高度去甲基化。OPG基因啟動子在OPF組與非OPF組均被低水平甲基化，但是OPF組中的甲基化水平高得多。這些結果表明，DNA甲基化通過抑制RANKL和OPG表達從而影響OPG-RANKL系統失衡，導致骨質疏松的發生。

DNMT3A介導DNA甲基化，參與OC的生成、分化成熟。Nishikawa等[34]研究證明，DNMT3A通過S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosylmethionin，SAM)介導DNA甲基化，抑制干擾素調節因子8(interferon regulatory factor 8，IRF8)以調控OC生成，IRF8是OC表型的關鍵負調控因子，需要在表觀遺傳上沉默才能使OC生成。DNMT3A敲除小鼠OC前體不能在體外有效地分化成熟，DNMT3A敲除小鼠模型與正常對照組相比，活性OC數量減少，骨量增加，然而給去卵巢的雌性小鼠(作為絕經后OP的模型)注射DNMT3A抑制劑Theaflavin-3，30-Digallate(TF-3)，發現活化OC數量減少，骨量增加，有利于防止骨丟失，提示抑制DNMT3A可能是預防骨丟失和控制絕經后OP的有益策略[10]。因此需要進行以OC活性過高為特征的OP和其他骨骼疾病的臨床試驗，進一步證實該結果，為探索OP新的治療方法帶來希望。

1.3 DNA甲基化對MSCs的影響

MSCs向OB分化的過程同樣也受DNA甲基化的調節。Cao等[35]進行了MSCs非誘導成骨分化和MSCs誘導成骨分化之間DNA甲基化水平的全基因組研究，發現在誘導MSCs組中CpG的大多數胞嘧啶被甲基化。Marofi等[36]發現ZBTB16和Twist1基因的啟動子區域中的DNA甲基化可能是控制MSCs向OB分化的主要機制之一。

Nomura等[37]研究發現DNMT3A和DNMT3B活性在MSCs軟骨分化過程中顯著上調，DNMT3A過表達顯著增強了MSCs軟骨分化能力。此外，Cakouros等[38]發現TET在MSCs分化中起關鍵作用。TET1可以抑制MSCs成骨和成脂分化，并且可能通過募集其他表觀遺傳修飾劑以間接發揮作用，而TET2則直接促進MSCs成骨和成脂分化。同樣地，在OP患者中TET1和TET2轉錄水平均被下調。靶向TET分子或其下游靶標可能提供新的治療策略，以幫助防止骨丟失和創傷或疾病后的修復。

脂肪細胞和OB皆源自MSCs的中胚層譜系。Cho等[39]證明了DNA甲基化抑制劑5-氮雜2'-脫氧胞苷(5-Aza-2′-deoxycytidine，5-Aza-dC)在脂肪形成和OB發生之間具有譜系確定作用。Wnt10a是決定間充質譜系走向OB的關鍵因素。Wnt10a 5'-區域富含CpG位點，5-Aza-dC能夠顯著降低其甲基化水平，上調Wnt10a基因表達，提示5-Aza-dC可通過抑制3T3-L1脂肪前體細胞中的DNA甲基化而顯著抑制脂肪生成，并促進OB生成。因此，DNA甲基化抑制劑5-Aza-dC的應用可能為伴有肥胖癥的OP患者的治療提供新途徑。

2 DNA甲基化研究對骨質疏松癥預防、診斷、治療的意義

2018年中國首個OP流行病學調查發布，結果顯示我國50歲以上人群的OP患病率為19.2%，50歲以上女性的OP患病率高達32.1%，65歲以上女性的OP患病率更是達到了51.6%。我國低骨量人群數量大，在不良生活習慣與年齡增加等多因素影響下，其患OP的風險進一步加重，且普遍對OP認知不足，骨密度檢測率低，預防意識不強。因此，如何有效、科學地防治OP是當前亟待解決的公共健康問題。但目前在治療過程中尚沒有合適的指標可以預示患者的新發骨折風險，同時也缺乏合適指標用于治療早期監測藥物療效與指導臨床醫師治療方案的選擇[40]。

在細胞分化過程中，DNA甲基化是動態的，但某些DNA甲基化模式可能會以表觀遺傳記憶的形式保留，且DNA甲基化能夠產生穩定的表觀遺傳效應[41]。盡管存在外部干擾，但由于甲基化的高穩定性以及穩定表觀遺傳效應，它們仍可以在眾多生物樣品中作為指導診斷、預后、治療的生物標志物。然而，目前仍無甲基化測試應用于臨床OP篩檢治療，且外周血DNA甲基化模式是否可以作為OP生物標記的研究較少且研究結果不一致[42]。因此，目前外周血DNA甲基化標記用于OP患者的篩檢和療效的監測是否可行仍然存疑。

Fernandez-Rebollo等[43]比較分析了16名非OP患者與32例原發性OP患者的外周血全基因組DNA甲基化譜，但未在OP患者中發現任何一個CpG位點存在顯著異常甲基化。同上述結論相反，Reppe等[44]研究測試了患OP和健康的絕經后婦女骨骼和血液中的DNA甲基化分布，在對應100個表達水平與BMD最顯著相關基因的2 529個CpG位點中，有63個CpG位點的甲基化水平在患OP女性和健康女性之間存在統計學上的不同，其中有53個CpG位點患OP婦女的甲基化水平高于健康婦女。絕經后婦女中間組結果(其BMD水平和臨床特征介于患OP女性和健康婦女之間的中間水平)也證實了63個CpG位點中的84%為中間DNA甲基化水平。隨后測試了來自獨立隊列血細胞中選定的骨CpG的甲基化水平。此分析局限于450名68歲及以上獻血者中的250名白人婦女。總共選擇了63個CpG甲基化位點進行測試。有趣的是，在獨立的隊列中，血液中的63個CpG中有13個也顯示與BMD相關。當比較高骨密度和低骨密度時，其中的12種CpG(除UGP2中的cg12876517以外)沿著與骨骼相同的方向改變，因此表明骨骼和血液中的DNA甲基化調節機制相似[44]。Cheishvili等[45]檢測了22名正常女性和22名絕經后OP女性(51～89歲)的外周血全基因組DNA甲基化譜，在對比分析得出的1 233個差異甲基化的CpG位點列表中進一步進行熱圖和聚類分析，最終發現差異最顯著的77個CpG位點的差異甲基化可有效區分非OP者與OP患者，提示這些位點與OP有關。在早期OP患者中也發現了這些差異位點，因此這些位點也可作為OP早期外周血生物標記。

表觀遺傳修飾劑可緩解OP的發展，如DNA甲基化抑制劑5-Aza-dC可改善廢用性OP發展[46]。但目前表觀遺傳修飾劑用于OP治療仍然難以實現。因此，表觀遺傳修飾劑臨床實驗研究的開展對OP的治療具有重大意義。例如開展在外周血DNA甲基化模式的大規模研究可進一步幫助確定外周血DNA甲基化標記與OP的相關性，使外周血DNA甲基化標記用于OP患者的篩檢和療效的監測成為可能。

3 總結

DNA甲基化在骨代謝和OP等年齡相關性疾病中具有重要作用且通常與基因表達的抑制有關。DNA甲基化影響OB的分化和MSCs成骨分化譜系確定，并在OC的分化、成熟以及OC和OB間平衡的調控中發揮作用。盡管存在外部干擾，但由于甲基化具有很高的穩定性，它們仍具有在眾多生物樣品中用作指導診斷、預后、治療的生物標志物的潛力。但目前仍無OP針對性的甲基化測試，外周血DNA甲基化標記用于OP患者的篩檢和療效的監測是否可行仍然存疑。因此致力于尋找外周血中OP相關甲基化生物標記及外周血DNA甲基化模式作為OP生物標記可行性驗證的研究，對早期OP患者的發現診斷、指導治療方案的選擇以及個體化精準治療OP具有重大的意義。