piRNA在結直腸癌中的研究進展

張 偉 溫珍平

1 內蒙古醫科大學，內蒙古呼和浩特市 010059； 2 內蒙古自治區腫瘤醫院腫瘤內科

結直腸癌在全球發病率和死亡率都很高，嚴重威脅著人類的生命健康,在我國結直腸癌是臨床常見的消化道惡性腫瘤，發病率呈上升趨勢，患者初診時多處于進展期[1]，因此，亟待尋求適宜結直腸癌早期診斷的標志物。piRNA于多種人類組織中以組織特異性的方式表達，在轉錄或轉錄后水平上調節關鍵的信號通路，已經有研究證明piRNA與多種消化道腫瘤的發生發展密切相關，并在這些腫瘤類型中發揮著不同的作用，包括促進和抑制腫瘤。 piRNA是一類小非編碼RNA，可與PIWI蛋白結合從而調控基因轉錄沉默過程、修飾異染色質和維持生殖系和干細胞功能等[2]。此外，腫瘤中piRNA的潛在機制也是多種多樣的，包括表觀遺傳調控、轉錄后調控和翻譯后調控。本文闡述piRNA相關作用機制，尤其是piRNA在結直腸癌中的作用及機制的最新研究進展，為結直腸癌的診斷治療提供參考依據。

1 piRNA簡介

在人類基因組中很少的基因(約2%)參與編碼蛋白質, 而其余近98%的基因不可編碼蛋白質[3]。所以根據其是否可編碼蛋白質，RNA被分成編碼 RNA和非編碼RNA兩大類。非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)是基因產生的轉錄本，直接起到結構、催化或調控RNA的作用，其占轉錄組90%以上[4]，根據生物學功能分為調控性非編碼RNA和管家非編碼RNA。前者包括微小RNA(microRNA)、長鏈非編碼RNA(lncRNA)、小干擾RNA(siRNA)和與PIWI蛋白相互作用的piRNA；后者包括轉運RNA(tRNA)、核糖體RNA(rRNA)等。piRNA主要在生殖細胞表達，是在性腺中觸發RNA沉默的一類小非編碼RNA，piRNA的5，端首位常為單磷酸的尿嘧啶核糖核酸，3’末端被甲基化修飾，通常長23～30nt，與PIWI亞家族的生殖系特異性Argonaute蛋白形成piRNA沉默復合物[5-6]。

真核生物的Argonaute蛋白在進化過程中漸演變成三種蛋白質亞家族：ago蛋白、wago蛋白和PIWI蛋白，前兩者主要參與由siRNA和miRNA引起的轉錄后基因沉默；PIWI蛋白主要與piRNA相互作用，在生殖細胞的轉座沉默過程中通過轉錄后基因沉默和轉錄基因沉默發揮重要功能[7-8]。在PIWI蛋白含有由paz和PIWI組成的結構域，當piRNA與PIWI蛋白結合時，paz優先結合piRNA中間體和5’尿嘧啶，piRNA通過3’端可被核糖核酸酶切割成熟，隨后由Hen1甲基化而產生成熟的piRNA-PIWI復合體，從而影響轉座子沉默、精子發生、基因組重排、表觀遺傳調控、蛋白質調控和生殖細胞維持[9]。

piRNA根據其來源，也可分為3類：轉座子來源的piRNA、mRNA來源的piRNA和lncRNA來源的piRNA[10]。轉座子派生的piRNA是從兩條基因組鏈上轉錄而來，同時產生正義和反義的piRNA；mRNA派生的piRNA經過加工，通常來自3’非翻譯區；lncRNA派生的piRNA來自整個轉錄本。自piRNA被發現以來，已有了長足進展，但人們對piRNA生物學的許多方面仍然知之甚少，可能歸于兩個主要原因：第一，piRNA的生物發生和沉默機制較其他的小RNA途徑(如miRNA和siRNA)更復雜；第二，piRNA系統對性腺組織的限制長期以來阻礙了體外系統分析[11]。根據目前研究，產生成熟的piRNA主要靠兩種機制：初級合成機制和‘乒乓’擴增機制。依據生物發生途徑，piRNA可以分為初級piRNA和次級piRNA。初級piRNA的生物發生必須生成轉錄本，然后產生piRNA分子，并將其輸出到細胞質中的加工位點。轉錄物被裂解成piRNA中間體，然后被加載到PIWI蛋白中，隨后被修剪和甲基化以產生成熟的piRNA-PIWI復合物。初級piRNA和PIWI在細胞質中由piRNA引導啟動靶切割，切斷它們的目標轉錄本，被切割的轉錄本就被處理成次級piRNA。這種目標降解和piRNA擴增反應稱為“乒乓循環”。實際上到目前為止，piRNA的功能仍不十分清楚。

2 piRNA與腫瘤

現有研究已證明piRNA在轉錄或轉錄后水平的生理和病理過程中發揮著重要作用，越來越多的證據也表明，piRNA與腫瘤細胞的惡性表型和臨床分期密切相關。研究發現piRNA可于腫瘤組織中異常表達，如piR-651在非小細胞肺癌高表達，通過誘導cyclinD1和CDK4的表達來調節細胞增殖，從而促進腫瘤轉移[12]；piR-823在多發性骨髓瘤患者中表達上調，其過表達與多發性骨髓瘤的臨床分期呈正相關，抑制piR-823使得整體DNA甲基化減弱，導致甲基化沉默的p16INK4A抑癌基因被重新激活[13]；腫瘤中不只表達一類piRNA，各類piRNA在不同腫瘤中表達類型、水平不一，如胃癌中piR-32105、piR-58099和piR-59056表達增加，piR-823表達降低；肺癌中piR-55490表達下調，piR-651表達上調；在腎癌細胞中piR-43607、piR-32051和piR-39894的表達會上調[10]；piR-651在胃癌、肺癌、間皮細胞、乳腺癌細胞、肝癌細胞和宮頸癌細胞中表達上調，其水平與胃癌淋巴結轉移(TNM)分期相關，piR-651抑制劑能抑制胃癌細胞生長，使其阻滯于G2/M期，是癌癥診斷的潛在標記物[14]；乳腺癌中piR-4987高表達與淋巴結轉移有關[15]，表明piRNA在腫瘤細胞增殖、轉移甚至治療中起重要作用。此外，piRNA為26～32nt的短RNA片段，意味著piRNA不容易被降解，也意味著piRNA可穿過細胞膜，可能在體液中易被分離獲得[16]。這些特征使得piRNA可以在患者樣本中被檢測到，因此可能成為腫瘤發生發展過程中潛在的診斷和預后生物標志物。

3 piRNA 與結直腸癌

piRNA在結直腸癌中的生物學功能和相關的臨床研究仍處于起步階段。但現有的諸多證據表明piRNA在結直腸癌組織的研究極富潛力。結直腸癌組織中piRNA異常表達，但作用不同，其中一些piRNA，如piR-823、piR-54265、piR-1245、piR-18849、piR-19521和piR-17724促進腫瘤的形成，而例如piR-017724、piR-015551、piR-5937、piR-28876、piR-001311、piR-004153、piR-017723和piR-020365具有抑制作用[17]，其中piR-015551序列屬于LNC00964-3，piR-015551在結直腸癌細胞中會顯著升高且與LNC00964-3呈正相關，表明piR-015551可能是由LNC00964-3產生并參與了結直腸癌的發生發展過程[18]。除此之外piR59056、piR-54878和piR-62701在結直腸癌組織中也高表達，并與預后有關[11]。由此可知piRNA在結腸癌的作用不甚相同，循其特性進行研究、分類。

3.1 piRNA與結腸癌的早期診斷 結直腸癌在早期通常缺乏典型癥狀，大多數患者被診斷為晚期，因此，早期發現是預防和改善結直腸癌患者生存質量的關鍵。 目前研究證明piRNA有機會作為結直腸癌早期檢測的非侵入性生物標志物。2018年歐洲學者研究指出：piRNA在癌癥患者的血清中被發現與健康人群相比顯著降低。根據piR-5937和piR-28876的水平，可以高度敏感和特異地區分癌癥患者和健康人群。此外，這兩種piRNA在Ⅰ期疾病患者中具有不錯的診斷性能，并且比結腸癌目前使用的生物標記物CEA和CA19-9表現出更高的靈敏度。在手術切除后1個月，血液中的piRNA的表達也明顯恢復[19]。piR-5937和piR-28876對結直腸早期診斷和預后評價作用也證明了piRNA研究的必要性。有研究表明：結直腸癌患者血清中的piR-020619和piR-020450會持續升高，但二者在肺癌、乳腺癌和胃癌患者血清的表達無明顯變化，而且它們聯合應用有顯著的診斷價值，敏感性達72.50%，因此，這兩種piRNA可能作為結直腸癌特異性循環腫瘤標志物，適用于癌前病變的早期發現，有助于降低結直腸癌的發病率和死亡率。而且多種piRNA如piR-57125可在血清和血漿樣本中保持穩定，可以作為極具潛力的結腸癌早期檢測生物標志物，以及可用于治療后患者的潛在監測標志物。

3.2 piRNA與結腸癌的發生發展 研究表明，在多種腫瘤組織中檢測到異常的piRNA表達，有助于腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲、干性維持和耐藥性。piR-015551序列在結直腸癌組織中高表達，是因為piR-015551能改變piRNA的二級結構[18]。發現piR-823在結直腸癌組織中表達上調，其可使細胞周期阻滯在G1期，并誘導細胞凋亡，這樣piR-823通過上調HSF1的磷酸化及其轉錄后的活性來促進癌癥的形成。而piR-54265通過激活STAT3信號通路促進細胞增殖，促進結直腸癌細胞的轉移和侵襲，從而發揮致癌作用。此外，piRNA的表達水平與結直腸癌的臨床分期和預后密切相關,如：piR-1245的高表達可能與晚期結直腸癌和淋巴結轉移有關。最近的研究發現，多種癌癥中piRNA的表達經常被解除調控，因此，在結直腸癌中被鑒定為過表達的piR-24000，可能是一種未被發現的潛在致癌的piRNA，并與侵襲性表型相關[20]，實際上，許多piRNA在結直腸癌發生發展過程中如何發揮功能我們尚不得而知。

3.3 piRNA與結腸癌預后治療 與鄰近的健康組織相比，結直腸癌患者腫瘤組織中piRNA的表達會顯著下調。因此，piRNA有可能會作為腫瘤抑制因子發揮作用。在一些研究也表明，高水平的piRNA表達與多種癌癥有關，抑制piRNA表達可以抑制癌癥的發展[16]，但還需要通過詳細的體外和體內研究來證實。相關研究發現：piR-54265在結直腸癌組織中的表達高于非腫瘤組織，且腫瘤或血清中的高水平與患者的生存不良顯著相關，而用piR-54265抑制劑治療可顯著抑制小鼠移植性腫瘤的生長和轉移。在該研究中發現：過表達的piR-54265可以防止結直腸癌細胞發生凋亡，并且與結直腸癌患者對抗癌藥的耐藥性和不良預后有關，但piR-54265水平是否能真正明顯影響患者生存期仍待考究[21]。不過所有這些發現表明，piRNA可能是一個治療靶點，可以作為一種腫瘤RNA來預測結直腸癌的臨床轉歸。Weng等[22]發現piR-1245可作為結直腸癌潛在的預后生物標志物。piR-1245的功能被證明是一個癌基因，并促進了腫瘤的發展。由于piRNA可以誘導靶基因的表觀遺傳沉默，這些基因在未來也可能成為潛在的治療工具。2019年有研究指出piR-19521的表達僅與腫瘤分化程度呈負相關，但piR-18849的表達與淋巴結轉移潛能呈正相關，而且與腫瘤的分化程度呈負相關[23]。這表明piRNA不僅可以作為潛在的治療靶點，還可以作為判斷結直腸癌患者預后的指標。此外，piRNA還可能參與免疫過程，piRNA的生物合成及其在增強防御中的作用與適應性免疫系統對病原體的防御有一些相似之處。piRNA與表觀遺傳變化、基因和蛋白質調控、基因組重排和其他調控過程密切相關。雖然這些研究表明piRNA和T細胞調節之間可能存在聯系，但piRNA如何通過改變其表觀遺傳狀態來調節T細胞參與免疫過程仍有待探索。piRNA具有結合能力的優勢為結直腸癌提供了一種治療干預的手段，但遠未成熟，這對結直腸癌實現精確的靶向治療和改善預后提出了挑戰。

4 結語

除了有數量巨大的piRNA，在大鼠中也已經發現可與 piRNA 相結合的被廣泛表達的 rRecQ1 蛋白， 并且與翻譯抑制相關聯[24]，且piRNA不僅局限于生殖系細胞組織，在腫瘤組織、中樞神經系統和其他體細胞組織中也都有表達，與癌癥類型、臨床分期和淋巴轉移相關的piRNA表達水平還存在個體差異[25]，這使得piRNA的研究面臨著巨大的工程量。雖然piRNA無論在結直腸癌作用機制還是臨床應用都極具潛力，但面臨的挑戰也同樣艱巨，亟待探索研究。