基于網絡藥理學及分子對接探討消渴腎安湯治療糖尿病腎病的作用機制

陳錦英 李汶航 齊昊天 聶維辰 米佳 南征

(1長春中醫藥大學，吉林 長春 130117;2成都中醫藥大學附屬眉山醫院；3北京中醫藥大學；4 長春中醫藥大學附屬醫院)

糖尿病腎病(DKD)的主要臨床表現為血糖增高伴進行性腎衰竭〔1〕，可導致終末期腎病(ESRD)。現代治療DKD常采用糾正高血糖、高血壓和血脂異常對癥治療及改變生活方式等方法延緩腎臟衰竭的進程。中醫認為，DKD屬于“消渴腎病”范疇，病理的關鍵在于肺、脾、腎功能失調〔2〕。中醫藥目前已廣泛應用于腎病及其并發癥的治療，可改善腎功能、有效延緩腎衰竭進程，以“邪伏膜原，毒損腎絡”為病機關鍵，創立消渴腎安湯〔3〕,通過導邪解毒益腎通絡之法治療DKD，在臨床治療中療效確切。但目前對相應中藥配方組合的研究尚缺少對應的評判標準，需要一項相對統一的研究方法對中藥復方進行研判，因此采用網絡藥理學將疾病和藥物整合到生物分子網絡中，預測活性成分和作用機制。本研究采用網絡藥理學方法及分子對接技術探索消渴腎安湯治療DKD的潛在作用機制。

1 材料和方法

1.1消渴腎安湯生物活性成分和靶點篩選 藥物成分及靶點篩選：在TCMSP數據庫中檢索消渴腎安湯組成藥物大黃、土茯苓、黃芪、黃精、覆盆子、金蕎麥、木蝴蝶、丹參、檳榔、草果、厚樸的活性成分，設定口服生物利用度(OB)≥30%、類藥指數(DL)≥0.18，對活性成分進行篩選，若無法獲得相關靶點信息則將有效成分進行靶點預測。預測相關性成分潛在靶點：從Pubchem數據庫獲取相關有效成分的結構化數據格式(SDF)結構，隨后將所得的結構通過Swiss Target Prediction數據庫進行靶點預測，取其中評分0.1的靶標作為潛在靶點。將所得的藥物成分和相關靶點以Cytoscape8.9.2構建“藥物-靶點”網絡，選取其中Network Analyzer模塊對本方的結構網絡進行分析。

1.2DKD靶點篩選 以“DKD”為關鍵詞，檢索OMIM、Disgenet、Genecards等數據庫，將取得的靶點進行合并、去重，得到疾病作用靶點。

1.3消渴腎安湯活性成分與DKD共同靶點的篩選 利用微生信(網址：http：//www.bioinformatics.com.cn/)將二者靶點取交集并繪制韋恩圖。

1.4蛋白相互作用(PPI)網絡 利用Metascape平臺(https://metascape.org/)對共同靶點進行分析，獲得Metascape Gene List Analysis Report。將獲得的PPI導入Cystoscap8.9.2中工具進行優化處理。以“homo sapiens”模塊對導入的相關靶點進行分析，通過Network Analyzer工具進行拓撲分析，以度值、介值、平均最短路徑和緊密度這四個參數進行參考，將其中分值排序前10的基因作為核心靶點。

1.5基因本體(GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析 以R軟件的Bioconductor包對相關基因作GO與KEGG富集分析，選取其中P<0.05的通路進行注釋，以條形圖和氣泡圖形式輸出所獲得的通路和生物學功能。

1.6分子對接 使用Schr?dinger Maestro軟件對相關成分和靶點進行分子對接，以Protein Preparation Wizard模塊預處理相關受體并進行優化，利用OPLS3e力場進行約束最小化， LigPrep模塊的默認設置制備相關化合物的結構。以Glide模塊導入制備好的受體，預測相應的對接位點。以標準對接(SP)方法對分子進行對接并完成篩選。根據其中化合物與蛋白間的作用情況預測化合物與蛋白殘基作用的特點，參考化合物的對接分值，推測擬篩的化合物活性特點。

2 結 果

2.1消渴腎安湯潛在生物活性化合物和靶點 共得到主要活性成分149個，主要活性成分分析見圖1。

圖1 消渴腎安湯有效成分

2.2DKD靶點篩選 以“DKD”為關鍵詞分別在OMIM、Disgenet、Genecards 數據庫進行檢索，將獲得到的疾病靶點合并去重后，按照Score≥中位數值的目標靶點為界值，篩選到1 372個疾病靶點。

2.3藥物活性成分-疾病共同靶點篩選 將篩選的消渴腎安湯活性成分靶點與DKD靶點取交集，并通過微生信軟件繪制韋恩圖(VEEN)，得到消渴腎安湯與DKD共同靶點76個。顏色隨著Degree值增加而加深，表明該成分越重要，其中活性最強的成分為C13：Baicalin(黃芩苷)，見圖2。

紅色：活性成分靶點，綠色：消渴腎安湯活性成分

2.4PPI構建 將76個共同靶點導入Metascape平臺，并通過分數進行排序得到相關靶點基因NR3C1、RELA、FOS、PCNA、ESR1、MDM2、CCND1、IL6、MTOR、IKBKB。

2.5MCODE模塊注釋 將已經構建好的PPI導入Cystoscap8.9.2中，使用MCODE模塊進行基因簇的分析及核心靶點的篩選。總共得到5個基因簇和5個核心基因(PRKCA、EGFR、ESR1、CYP2C9、ERBB2)。見圖3。

圖3 PPI與MCODE模塊注釋

2.6GO富集分析和KEGG通路分析

2.6.1GO分析 分別通過GO分析選取生物學過程、細胞組分及分子功能3部分對41個共通基因進行注釋分析。結果顯示，交集基因集合共涉及3 299條生物學過程，主要為對類固醇激素的反應、對藥物的反應、對酮的反應、細胞對化學應激的反應和對氧化應激的反應等方面；交集基因集合共涉及237條細胞組分表達過程；主要為血漿脂蛋白顆粒、脂蛋白顆粒、蛋白脂復合物、基質膜和膜筏等組分；交集基因集主要參與377個與分子功能相關的過程，主要有核受體活性、配體激活的轉錄因子活性、類固醇結合、DNA結合的轉錄因子結合和轉錄輔因子結合等相關功能。見圖4。

AGE-RAGE:晚期糖基化終末產物-糖基化終末產物受體

2.6.2KEGG分析 76個共同靶點共富集得到106條KEGG通路，前10的關鍵通路見圖5，富集到通路的靶點根據degree值排序，得到RAF1、BCL-2兩個最重要的靶點。

圖5 KEGG 通路富集

2.7分子對接驗證 RAF1、BCL-2與黃芩苷結合能分別為-8.148、-7.265 kCal/mol。另外蛋白與小分子的復合物采用Pymol2.1進行可視化分析，見圖6。黃芩苷化合物與靶點蛋白存在很好地結合作用且匹配度高，結合能均小于-5 kCal/mol。將對接后化合物與蛋白形成的復合物利用Pymol2.1軟件進行可視化，得到化合物與蛋白的結合模式，根據結合模式可以很清晰看到化合物與蛋白口袋相結合的氨基酸殘基。

圖6 黃芩苷與RAF1、BCL-2分子對接驗證

3 討 論

失調的內分泌代謝環境是導致DKD的重要原因之一，臨床研究表明高血糖在 DKD 起始中起關鍵作用，但其在控制進展的具體意義仍不明確。有可追溯的研究發現許多2型糖尿病(T2DM)患者在被診斷患有糖尿病之前可能已經經歷了多年的代謝改變〔4,5〕，所以導致他們被診斷為 T2DM 之前就已患上DKD〔6〕。據統計，美國約有200 000例DKD患者接受ESRD護理，且接受透析的人數以每年約5 000的數目遞增。即便如此，接受RSRD護理的DKD患者仍面臨約20%的年死亡率，這遠超許多實體癌(包括前列腺癌、乳腺癌甚至腎細胞癌)的死亡率〔7〕。對于DKD患者，缺乏特異性西醫治療，最直接有效的治療方法是控糖、抑制腎病進展。中藥方劑具有多成分、多靶點、多途徑的特點，由于其復雜的特性，導致僅靠普通的研究方法很難解釋其藥理機制。本研究推測黃芩苷可能是消渴腎安湯中發揮關鍵作用的潛在活性成分。事實上，黃芩苷具有抗炎〔8〕、抑癌癥〔9〕、保肝作用〔10〕，具有很強的抗氧化作用〔11〕。

Raf 包括A-Raf、B-Raf、C-Raf(即RAF1)，是GTP結合蛋白Ras所募集的主要效應因子，能激活有絲分裂原活化蛋白激酶(MEK-MAP)激酶通路〔12〕。A-Raf、B-Raf、c-Raf 的序列和功能相似，但是調節方式各不相同〔13〕，c-Raf的活化涉及多個激活位點(包括 Ser338、Tyr341、Thr491、Ser494、Ser497 和 Ser499)的磷酸化。c-Raf 上的抑制性 14-3-3 結合位點 Ser259 和 Ser621 可以分別由 Akt 和腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)來磷酸化〔14,15〕，而c-Raf 蛋白的失活特性與Ser29、Ser43、Ser289、Ser296、 Ser301 和 Ser642 位點的過度磷酸化相關，并依賴于下游的 MEK 信號轉導，從而導致 c-Raf 對后續的激活事件無反應〔16〕。在各種凋亡刺激因子作用下，BCL-2可通過抑制線粒體細胞色素c的釋放而發揮存活功能〔17〕，它與線粒體鈣穩態和質子流的調節有關〔18〕。現已發現BCL-2的Thr56、Ser70、Thr74 和 Ser87等磷酸化位點〔19〕。經證實，這些磷酸化位點可能是凋亡信號調節激酶(ASK)1/絲裂原活化蛋白激酶(MKK)7/應激活化蛋白激酶(JNK)1通路的靶標〔20〕，并且BCL-2 的磷酸化可能是有絲分裂活動的一個標志〔21〕。白細胞介素3和JNK誘導的 BCL-2 在 Ser70 位點磷酸化，可能對增強抗凋亡作用至關重要〔22〕。DKD患者體內的高糖環境，使腎臟細胞的氧化代謝活動受到影響，在缺氧和炎癥刺激的雙重作用下，腎臟細胞出現凋亡、壞死，因此DKD患者的治療目標是保護腎臟，改善體內高糖環境。研究表明，脂肪酸氧化向糖酵解的轉化可以產生類似于促進腫瘤細胞增殖和凋亡逃逸的作用，提高細胞在缺氧條件下的存活率〔23,24〕。本文證實了消渴腎安湯的潛在作用機制是基于多個靶點和多個信號通路的協同作用。富集途徑主要涉及類固醇激素反應、對酮反應、細胞化學應激、氧化應激、皮質類固醇反應、輻射反應調節等方面。線粒體功能障礙與氧化應激和酮代謝密切相關〔25～27〕。研究表明，DKD患者存在明顯的氧化應激反應導致的線粒體功能障礙〔28〕，有類似研究發現，木蝴蝶莖皮的主要提取物(黃芩苷和白楊素)可通過升高蛋白激酶(PK)C，降低核轉錄因子(NF)-κB及AGEs/RAGE，改善細胞氧化應激及炎癥反應〔29〕。由此可以推測，消渴腎安湯治療DKD的主要機制可能是下調炎癥因子的表達，對抗氧化應激，從而抑制腎臟內細胞氧化應激狀態、抑制細胞凋亡。更重要的是，保護線粒體可能是消渴腎安湯治療DKD的潛在機制。

綜上，黃芩苷可能通過作用于RAF1、BCL-2這兩個靶標影響后續生物學通路的激活，從而調節DKD的進展。