“通督調臟”針法對CUMS大鼠行為學及海馬組織蛋白表達的影響

金紅 齊泰煜 樊帥 李光英 錢家坤 謝雨虹 張琪 高美云 高敏香 張敏,4

(長春中醫藥大學 1中醫學院，吉林 長春 130017；2針灸推拿學院；3附屬醫院腦病中心神志門診；4附屬醫院針灸臨床中心)

抑郁癥以顯著而持久的心境低落為臨床特征，為疾病負擔最重的精神疾病〔1〕。目前西藥抗抑郁譜窄、易復發等缺陷〔2〕、抗抑郁藥物研發進展緩慢。督脈和足太陽經被選擇頻率最高〔3〕，但在辨證治療上經絡辨證和臟腑辨證分庭抗禮。通督調臟針法源自《黃帝內經》中督主神志、五神臟理論和長白山通經調臟手法流派的經絡-臟腑相關理論，以百會、印堂、五臟俞為主穴，以臟腑-經絡結合辨證為特點，前期研究發現其能改善抑郁、焦慮等核心及周邊癥狀，起效速度快于五羥色胺再攝取抑制劑(SSRIs)藥物〔4〕，并在實驗中明確了百會、印堂的抗抑郁療效和作用機制〔5〕，但還需利用現代生物工程技術對通督調臟針法進行深入研究。

定量蛋白質組學為分子分析、生物標志物識別、探索發病機制的重要方法，其整體性、系統性、綜合性與中醫臟腑-經絡辨證相符，應用4D Label free定量蛋白質組學檢測技術發現針刺可通過保護海馬突觸和線粒體功能改善發揮抗抑郁作用〔6〕，相關差異蛋白可能為疾病診斷和治療的新靶點〔7〕。但目前尚無督脈聯合五臟俞抗抑郁的蛋白質組學研究。慢性不可預見性應激抑郁模型(CUMS)在行為學表現、生化及神經病理改變上與臨床變化高度相似，為最有效和最常用的抑郁模型〔8〕。海馬為情緒產生和調節的重要腦區，其神經元丟失、蛋白改變被認為與抑郁癥關系密切〔9〕。本研究探討通督調臟針法對CUMS大鼠海馬組織蛋白表達的影響及可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 由長春中醫藥大學動物實驗中心提供，健康SPF級SD雄性大鼠(4周齡)27只，體重180～220 g，飼養溫度23～25℃，濕度50%～60%，自然節律光照，自由進食進水，適應飼養1 w，飼養環境清潔。該實驗已通過長春中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查(批準編號：2020336)，全程遵守《關于善待實驗動物的指導性意見》中相關規定。將動物隨機分為正常組、模型組、針刺組，每組9只，進行行為學數據分析，各組隨機選取3只進行蛋白質組學檢測。

1.2主要試劑和儀器 蛋白酶抑制劑(德國Merck Millipore)、胰蛋白酶(美國Promega)、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、甲酸(美國Fluka)、尿素(美國Sigma-Aldrich)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)。乙腈、Bruker timsTOF Pro質譜儀(德國Bruker)、Orbitrap ExplorisTM480高分辨質譜儀EASY-nLC 1 200超高效液相系統、Q Exactive系統(美國ThermoFisher Scientific)。

1.3針具和其他材料 一次性不銹鋼毫針(規格：0.25 mm×25 mm，貴州安迪藥械有限公司)、無菌棉簽、75%消毒酒精。其他器材：離心管、醫用橡皮管、自制游泳池(61 cm×35.5 cm×43 cm)、華佗牌電針儀(SDZ-II，蘇州醫療用品廠有限公司)等。

1.4大鼠CUMS模型制備 造模方法參照Willner等〔10〕方法建立CUMS抑郁模型，造模各組孤養并每日隨機給予以下刺激的一種：斷食24 h、斷水24 h、晝夜顛倒24 h、夾尾3 min、束縛3 h、10℃冷水游泳5 min、潮濕墊料24 h，共21 d。

1.5各組干預方法 將SD大鼠隨機分成空白組、模型組、針刺組，每組9只。空白組正常群養，每日給予等量純凈水；模型組慢性不可預見性應激結合孤養，每日給予等量純凈水。針刺組慢性不可預見性應激結合孤養，于造模24 h后開始“通督調臟”針法治療，穴位參照全國針灸學會實驗針灸研究會制定的實驗動物針灸穴位圖譜，選取相當于人體解剖部位的百會、印堂、心俞、肝俞、脾俞、肺俞、腎俞。大鼠固定于鼠臺上，取穴消毒后毫針平刺百會、印堂7.5 ～12.5 mm，施平補平瀉法，選用華佗牌SDZ-Ⅱ型電子針治療儀，連接百會、印堂，疏密波，頻率2 Hz/15 Hz，強度為 0.1～1.0 mA，電流強度以針身微微顫動為度；針刺雙側心俞、肝俞、脾俞、肺俞、腎俞，斜刺7.5～12.5 mm，留針30 min，中間提插捻轉1次，1次/d，7 d為1個療程，共3個療程。

1.6行為學干預

1.6.1強迫游泳實驗 游泳池為長方形水池，長61 cm，高35.5 cm，寬43 cm，水深25 cm，水溫控制在(25±1)℃。測試時捏住大鼠尾巴距根部2/3 處將大鼠緩慢放入游泳池內，測定大鼠5 min內四爪均不動行為的累計時間，每只大鼠測定1次，在實驗第1天、第21天進行測試。

1.6.2糖水消耗實驗 大鼠斷水24 h，測1 h內蔗糖水攝入量(即測試前后瓶中水量之差)。給予1%蔗糖水，糖水與瓶的重量共計250 g，計算大鼠1 h飲用前后的總重量之差。分別在實驗的第1天和第21天測定。

1.7蛋白質組學檢測

1.7.1海馬組織蛋白提取 21 d后，大鼠斷頸處死，冰臺上迅速分離出海馬組織，記錄編號后液氮速凍，-80℃冰箱保存。各組選取3個有明顯表型變化大鼠的海馬樣本，至液氮預冷的研缽中，加液氮充分研磨至粉末。各組樣品分別加入粉末4倍體積裂解緩沖液(8 mol/L尿素，1%蛋白酶抑制劑)，超聲裂解。4℃，12 000 r/min離心10 min，去除細胞碎片，上清液轉移至新的離心管，利用BCA試劑盒進行蛋白濃度測定。

1.7.2胰酶酶解 各樣品蛋白取等量進行酶解，用裂解液將體積調整至一致。緩慢加入終濃度20%三氯乙酸(TCA)，渦旋混勻，4℃沉淀2 h。4 500 r/min，離心5 min，棄上清，用預冷的丙酮洗滌沉淀2～3次。晾干沉淀后加入終濃度200 mmol/L的四乙基溴化銨(TEAB)，超聲打散沉淀，以1∶50的比例加入胰蛋白酶，酶解過夜。加入二硫蘇糖醇(DTT)使其終濃度為5 mmol/L，56℃還原30 min。之后加入碘乙酰胺(IAA)使其終濃度為11 mmol/L，室溫避光孵育15 min。

1.7.3液相色譜-質譜串聯分析 肽段用液相色譜流動相A相溶解后使用EASY-nLC 1 200超高效液相系統進行分離。肽段經由超高效液相系統分離后被注入Capillary離子源中進行電離然后進Orbitrap ExplorisTM480質譜進行分析。離子源電壓設置為1.6 kV，肽段母離子及其二級碎片都使用高分辨的TOF進行檢測和分析。二級質譜掃描范圍設置為100～1 700。數據采集模式使用平行累積串行碎裂(PASEF)模式。一張一級質譜采集后進行10次PASEF模式采集母離子電荷數在0～5范圍內的二級譜圖，串聯質譜掃描的動態排除時間設置為20 s避免母離子的重復掃描。

1.8統計學方法

1.8.1行為學 采用SSPS26.0軟件，組間比較符合方差齊性檢驗采用單因素方差分析，方差不齊采用H檢驗；組內比較差值符合正態性分布采用配對樣本t檢驗，偏態分布采用符號秩和檢驗。

1.8.2蛋白鑒定和定量 通過質譜分析得到樣本的肽段質量和信號強度(一級譜)、肽段碎裂后碎片離子的質量和信號強度(二級譜)，使用Proteome Discoverer(v2.4.1.15)數據庫將蛋白序列構建的理論二級譜圖數與質譜分析得到的二級譜圖數比對，共鑒定到5 913個蛋白質，根據蛋白特異性肽段和蛋白質數總體情況及肽段在不同樣本中的信號強度值等信息計算蛋白相對定量值，使用Pearson相關性統計方法進行評估蛋白定量的重復性。

1.8.3差異蛋白篩選和生物信息學分析 將每個蛋白在兩個比較樣品中的相對定量值進行t檢驗，差異蛋白表達量變化超過1.5倍和小于1/1.5作為顯著上調和下調的變化閾值。篩選出的差異蛋白采用基因本論(GO)、KEGG通路和亞細胞定位等方法進行功能注釋和富集、聚類分析，3組差異蛋白富集分析使用Fisher精確檢驗，以觀察差異表達蛋白在不同功能類型中的富集趨勢和功能的相關性；根據數據庫編號或蛋白序列，通過STRING(v.11.0)蛋白網絡互作數據庫觀察差異蛋白互作關系。

2 結 果

2.1行為學結果 各組體重均有上升，7 d時模型組體重明顯低于空白組(P<0.000 1)，模型組與針刺組相比體重變化不明顯；與模型組相比，針刺組在治療14 d時體重顯著上升(P<0.001)，并在21 d時具有極顯著差異(P<0.000 1)，但與空白組相比仍具有極顯著差異(P<0.000 1)。強迫游泳實驗中，21 d時，與空白組相比，模型組不動時間明顯增加(P<0.000 1)；針刺組不動時間明顯低于模型組(P<0.000 1)，但與空白組相比仍具有顯著差異(P<0.01)。糖水消耗實驗中，21 d時，空白組、針刺組糖水消耗量明顯增加，模型組變化不明顯；模型組糖水消耗量顯著低于空白組(P<0.000 1)，針刺組糖水消耗量顯著多于模型組(P<0.000 1)，但與空白組相比仍具有顯著差異(P<0.01)，見表1。

表1 各組體重變化、強迫游泳實驗及糖水消耗實驗的比較

2.2生物學重復檢驗 隨機從空白組、模型組、針刺組中各選取3個樣本，共9個樣本進行3組3次生物學重復實驗，3組Pearson系數經3次重復后數值均>0.950。見圖1。

Pearson系數越接近-1為負相關，越接近1為正相關，越接近0為正相關

2.3差異蛋白鑒定 共鑒定到39個差異蛋白(閾值為1.5倍)，上調蛋白19個，下調蛋白20個；其中模型組相比空白組有10個上調蛋白(Mrps24、Rdh13、Bbs2、Tex2、Dmxl1、Snap29、Rlbp1、Afg1l、Cpped1、Cbx3)，12個下調蛋白(Cds1、Ighm、Arhgef6、Vtn、Slc12a9、Slco1c1、Cyp51a1、Plekhd1、Cib1、Pdf、Zfp512、C1qc)；針刺組相比模型組有9個上調蛋白(Clcc1、Sdf2、rCG_52671、Pdf、Tmem254、Gpr37、Scd2、Ttyh2、Ddx46)，8個下調蛋白(Coq8a、Ik、Specc1l、Phf5a、Ptn、Prpf40a、Bloc1s1、Cdk5rap3)，見圖2、表2。

圖2 差異蛋白火山圖

表2 差異蛋白變化

2.4GO富集分析 針刺組/模型組的差異蛋白主要參與補體激活、調控炎癥反應等生物學過程，并在補體激活、體液免疫應答反應、細胞投射組裝上具有極顯著的富集趨勢(P<0.01)；與針刺組/模型組的差異蛋白主要參與細胞周期相關調控、RNA代謝等生物學過程，并在細胞周期過程的調控中表現出極顯著的富集趨勢(P<0.01)，見圖3。

圖3 差異蛋白生物學過程GO富集

2.5聚類分析 根據富集分析得到的富集檢驗P值使用分層聚類法將不同組相關功能聯合繪制為熱圖，與空白組相比較，模型組蛋白在生物學過程上主要參與蛋白質活化調節、補體激活、炎癥反應、免疫調節等；與模型組相比較，針刺組蛋白主要參與細胞周期調節、RNA代謝過程、細胞形態調節等。KEGG聚類分析結果顯示模型組參與補體和凝血級聯激活過程，針刺組參與基因剪接過程，見圖4。

2.6PRM對目標蛋白定量分析 基于GO注釋及KEGG富集分析結果，選擇了D-多巴色素互變異構酶(Ddt)、Snap29、C1qc、Vtn、Cpped1、Phf5a、Prpf40a、Cdk5rap3、Bbs2、Afg11、Sdf2、Specc1l、Cnrip1等一系列與神經遞質合成及補體激活等密切相關的蛋白質進行PRM蛋白定量分析。結果顯示：與4D Label-free 結果一致的是，大鼠海馬中的Ddt蛋白在模型組下調，而在針刺組上調，Cnrip1蛋白在模型組上調，而在針刺組下調。此外，通過PRM未能識別到Snap29、C1qc、Vtn、Cpped1、Phf5a、Prpf40a、Cdk5rap3、Bbs2、Afg11、Sdf2、Specc1l等蛋白的表達。

3 討 論

抑郁癥發病機制復雜，額葉、丘腦邊緣系統等形成的神經網絡發生神經和細胞活動改變與抑郁癥密切相關，其中海馬區域神經元的萎縮和凋亡在抑郁癥發病中起重要作用，故常通過海馬組織理化變化作為觀察和評價抗抑郁療效的有效指標。本研究表明，針刺可糾正相關蛋白的異常表達來發揮抗抑郁作用；生物信息學分析發現共有18個差異蛋白參與了30種生物學過程，涉及神經遞質代謝、神經元自噬、補體激活、信號轉導、細胞周期調控、線粒體代謝等。本研究表明通督調臟針法在改善絕望情緒和快感缺失癥狀上有明顯療效。研究者的前期研究已發現電針百會、印堂可通過拮抗CUMS大鼠海馬各亞區蛋白激酶(PK)A、環磷酸腺苷反應元件蛋白(CREB)信號降低改善行為學癥狀〔11〕，且能修復五羥色胺(5-HT)系統缺陷進而增加腦和突觸間隙內的5-HT含量，達到與5-HT再攝取抑制劑(SSRIs)類藥物相同的藥理作用〔14〕，已有研究表明針刺五臟俞后的抗抑郁療效與SSRIs藥物相當，副作用低且穩定〔12〕，提示通督調臟針法具有明確的療效和科學依據。

在PRM驗證中得到的Ddt是一種蛋白質編碼基因，是具有趨化因子樣特征的細胞因子。Ddt是巨噬細胞遷移抑制因子(MIF)蛋白超家族的成員，其基因在序列、酶活性和基因結構方面與MIF相關，且兩者具有相似的互變異構酶活性及生物相似性〔13〕。MIF與多種疾病相關，在阿爾茨海默病等精神疾病中起重要作用，同時MIF的保護作用和病理作用又與抑郁癥有關，研究表明MIF可能通過神經內分泌以及免疫炎癥參與抑郁癥的發生、發展過程〔14〕。只有Ddt基因是唯一與MIF具有同源性的基因，且與MIF共同定位于22號染色體，在22號染色體上緊密相連〔15〕，筆者推測，Ddt可能和MIF有著一樣的作用路線，即在神經內分泌機制調節方面，由分泌促腎上腺皮質激素(ACTH)的垂體細胞分泌和產生醛固酮、糖皮質激素(GC)的腎上腺皮質的上皮細胞表達，當機體處于應激狀態時，下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸激活，外周血中ACTH、GC水平升高，從而對宿主發揮保護作用，此時HPA軸的激活導致Ddt大量產生，并釋放到血液循環中。本次研究中，通督調臟針刺后，CUMS大鼠的Ddt過表達，會正向影響黑色素合成，可能與MIF產生相同的作用，從而干擾多巴胺和5-HT等神經遞質代謝，影響抑郁發生、發展。神經元自噬的過度激活或抑制可影響神經突觸的傳遞過程而介導抑郁癥的發生。CUMS模型可引起海馬神經元發生自噬，Snap29通過形成SNARE復合體參與細胞自噬，其過表達可抑制突觸傳遞過程〔16〕，這一發現與本實驗結果相符，據此可推測通督調臟針法可通過降低Snap29的表達解除受抑制的突觸傳遞過程而發揮抗抑郁作用。補體經典激活途徑與抑郁癥存在明顯富集關系，通過 GO分析發現這些差異蛋白主要參與了補體激活、體液免疫反應、蛋白質活化級聯、蛋白質成熟及炎癥反應的調節。有研究表明， C1q和C3定位于未成熟的突觸，C3與小膠質細胞表達的補體蛋白C3a受體(C3aR)結合，在無功能的網狀突觸的發育修剪方面起了重要作用〔17〕。而抑郁模型小鼠杏仁核內發生神經炎癥，膠質細胞激活，表達補體C1q、C3，進一步激活小膠質細胞和星形膠質細胞修剪突觸，導致突觸含量降低，促使小鼠產生抑郁樣行為〔18〕。本研究表明，針刺可通過調節補體激活途徑的蛋白表達抑制神經炎癥，發揮抗抑郁作用。

磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路是近年來研究抗抑郁作用機制的重要通路之一〔19〕，PI3K通過磷酸化下游核心蛋白Akt進而啟動下游分子的表達，抑制細胞自噬和細胞凋亡。CUMS大鼠體內PI3K/Akt通路活性被抑制，而Cpped1通過去磷酸化Akt抑制其活性，加重細胞凋亡〔20〕，本實驗表明，針刺能夠通過降低Cpped1表達解除對Akt的抑制，減少CUMS大鼠的細胞凋亡。此外，本研究發現Prpf40a、Cdk5rap3廣泛參與細胞周期調控、細胞周期相變等多個生物學過程，Prpf40a在針刺后的表達量發生顯著下調，已有研究表明Prpf突變可導致細胞周期中前mRNA的積累和G1/S轉換受損〔21〕，Prpf40a和Prpf屬于同源家族，故推測CUMS大鼠受損細胞周期在針刺后得到修復。細胞周期素蛋白依賴性激酶(Cdk)5活性與應激相關疾病存在關聯〔22〕，并作為細胞周期抑制劑抑制異常細胞進入，但需要相關調節亞基激活其活性，Cdk5rap3為Cdk5調節亞基相關蛋白，本研究中針刺后的Cdk5rap3由上調轉為下調， Cdk5rap3過表達意味著抑郁癥發生中存在大量的異常細胞周期，而其表達下調可作為觀察抗抑郁作用發揮的有效表征。

線粒體能量代謝失常可導致活性氧(ROS)增加，加劇氧化應激反應，促進細胞凋亡。同時線粒體為神經突觸可塑性的重要細胞器，電針后突觸和線粒體蛋白發生顯著變化，提示電針通過保護海馬突觸和線粒體功能改善大鼠的抗抑郁性能。本研究中，Bbs2、Afg1l、Specc1l和Sdf2的亞細胞定位于線粒體，Bbs2、Afg1l、Specc1l針刺后表達量顯著降低，Sdf2針刺后表達呈上升趨勢，盡管目前尚無以上蛋白與抑郁癥線粒體代謝失常的明確證據，突觸與線粒體在電針干預中的靶向關系亦尚不明確，但這些蛋白可能是通過參與氧化磷酸化過程，降低ROS數量，修復發生斷裂的氧化電子呼吸鏈，進而調控突觸可塑性。綜上，通督調臟針法可能通過干擾神經遞質代謝、調節突觸傳遞過程、抑制神經炎癥，從而保護海馬神經元免受損傷，進而發揮抗抑郁作用。

本實驗還有許多不足之處，如對Ddt蛋白的文獻報道較少，需進行針對性研究才可進一步挖掘其抗抑郁途徑；再者Bbs2、Afg1l、Specc1l等蛋白在抑郁癥的發生、發展過程中的作用，也尚未完全清楚，對這些關鍵蛋白的深入研究和基因敲除將是我們下一步的研究方向。同時，聯合組學技術和靜息態功能磁共振成像(fMRI)技術開展經穴特異性研究，觀察臟腑辨證和經絡辨證結合下穴位個體之間、穴位與經絡之間的蛋白表達差異，構建臟腑-經絡-經穴-分子的針刺抗抑郁本體理論體系，將是循證醫學體系下針刺現代化研究的新走向。