顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及差異表達(dá)基因分析

閆學(xué)春，欒培賢，何立川

（中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，淡水魚(yú)類(lèi)育種國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150070）

鯉（Cyprinus carpio）是世界上和我國(guó)養(yǎng)殖范圍最廣的重要淡水魚(yú)類(lèi)之一[1-5]。目前我國(guó)已培育出許多遺傳性狀的鯉品種和品系，如豐鯉（Feng carp）、荷元鯉（Heyumn hybrid carp）、岳鯉（Hybrid yue carp）、三雜交鯉（Three hybridized carp）、美蓉鯉（Furong carp）等[6-10]。鯉雖適應(yīng)性強(qiáng)，耐寒，食性廣，生長(zhǎng)速度快，但其品質(zhì)較低（肌肉脂肪含量和鮮味氨基酸含量較低等）[11-14]。品質(zhì)性狀是鯉生產(chǎn)的主要研究目標(biāo)，對(duì)其品質(zhì)的遺傳改良也是育種工作的一項(xiàng)重要任務(wù)。但在改良魚(yú)類(lèi)的遺傳性，培養(yǎng)魚(yú)類(lèi)新品種，尤其是培育遺傳性狀穩(wěn)定的優(yōu)良新品種的復(fù)雜過(guò)程中，利用傳統(tǒng)育種技術(shù)試圖改良鯉科魚(yú)類(lèi)的品質(zhì)等培育速度還較慢，單純依靠傳統(tǒng)的選種和雜交育種往往難以達(dá)到目的，必須綜合運(yùn)用多學(xué)科的知識(shí)和多種現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，即將傳統(tǒng)的選育種技術(shù)和現(xiàn)代生物技術(shù)相結(jié)合才能更好地達(dá)到魚(yú)類(lèi)改良的目的。顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉是將中國(guó)對(duì)蝦總DNA 導(dǎo)入受體鯉內(nèi)，期望通過(guò)這兩種基因水平的遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)達(dá)到改善鯉的品質(zhì)，其優(yōu)點(diǎn)是外源基因的高水平表達(dá)，克服了鯉品質(zhì)性狀遺傳力低的問(wèn)題，使蝦基因的優(yōu)良性狀在受體鯉中得以體現(xiàn)。而通過(guò)外源基因的導(dǎo)入，作為生物遺傳改良、培育抗逆和快速生長(zhǎng)品種的一種有效技術(shù)手段，已成為應(yīng)用研究發(fā)展的重點(diǎn)[15,16]。

轉(zhuǎn)錄組（Transcriptome）廣義上指某一生理?xiàng)l件下，特定細(xì)胞類(lèi)群內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的總和，狹義上主要指mRNA[17]。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)（RNA-seq technology）是測(cè)序轉(zhuǎn)錄本的RNA 序列，獲得轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)和表達(dá)特征等相關(guān)信息。通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析，能發(fā)現(xiàn)新的基因以及基因表達(dá)差異分析，并對(duì)重要的代謝通路及其基因進(jìn)行定位，揭示了特定生物學(xué)過(guò)程中的分子調(diào)控機(jī)制[18-20]。目前，這一技術(shù)已廣泛應(yīng)用在魚(yú)類(lèi)研究中。如Ji 等[21]進(jìn)行鯉的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，鑒定出全長(zhǎng)cDNA 序列，其序列與斑馬魚(yú)（Barchydanio rerio var）、河豚（Takifugu rubripes）、青鳉（Oryzias latipes）、三刺魚(yú)（Gasterosteus aculeatus）相比較發(fā)現(xiàn)，有75.2%的contig 與斑馬魚(yú)的參考序列相接近，相似度最高；Liao 等[22]對(duì)鯽（Carassius auratus）的肌肉、腎臟、肝臟和腦等多種組織的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，腦部表達(dá)基因最多，分布在肌肉組織中的主要是上調(diào)基因，肝臟中主要分布的是下調(diào)基因，并挖掘出了高質(zhì)量的SNP 和微衛(wèi)星標(biāo)記；Mu等[23]在大黃魚(yú)（Larimichthys crocea）的脾臟等組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，經(jīng)過(guò)KEGG 注釋分析，分別得到了多個(gè)抗病毒免疫效應(yīng)因子；趙永麗等[24]對(duì)花斑裸鯉（Gymnocypris eckloni Herzensten）的肝、肌肉等多組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，為了解花斑裸鯉在高原特殊環(huán)境適應(yīng)、資源保護(hù)、相關(guān)功能基因特點(diǎn)、科學(xué)數(shù)據(jù)的積累方面的研究奠定了基礎(chǔ)。

本研究通過(guò)對(duì)顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉的肌肉轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和差異表達(dá)分析，找到與氨基酸相關(guān)的差異表達(dá)基因，并對(duì)這些差異表達(dá)基因做進(jìn)一步的功能分析，探明了顯微介導(dǎo)的外源基因在鯉品質(zhì)改良中的價(jià)值，為進(jìn)一步應(yīng)用于改善鯉品質(zhì)性狀提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉取自黑龍江水產(chǎn)研究所生物技術(shù)室，對(duì)照魚(yú)取自黑龍江水產(chǎn)研究所呼蘭試驗(yàn)站。顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉和對(duì)照魚(yú)各3 尾，均為2 齡。取背部肌肉組織，液氮保存?zhèn)溆茫砂龠~客生物科技有限公司完成文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序。

1.2 方法

RNA 提取：采用Trizol 方法提取實(shí)驗(yàn)魚(yú)和對(duì)照魚(yú)肌肉總RNA。分別取樣品50 mg 加入1 mL Trizol試劑，研磨，勻漿，培養(yǎng)細(xì)胞。向細(xì)胞裂解液中加入0.2 mL 的氯仿，充分顛倒混合，1 200 r/min 離心10 min，向上層水相中加入0.5 mL 異丙醇，離心，棄上層，加入1 mL 75%乙醇，7 500 r/min 離心5 min，棄上清，室溫干燥5 min，加入80 μL 無(wú)RNAase 水溶解RNA，待完全溶解后，-70℃保存。取適量RNA 樣品分別用紫外分光光度計(jì)NanoDrop 8000（Thermo Scientific）和1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA 的質(zhì)量和完整性。

轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)的構(gòu)建和測(cè)序：提取的總RNA 檢測(cè)OD260/280在1.86～1.96 之間，RIN 值在7～10 之間，濃度、體積、總量等都符合用于cDNA 測(cè)序文庫(kù)的構(gòu)建。cDNA 合成按照RT reagent Kit With gDNA Eraser（TaKaRa）反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。文庫(kù)的構(gòu)建參見(jiàn)王步勇等[25],具體流程如下：經(jīng)反轉(zhuǎn)錄，分離純化得到mRNA，再將mRNA 反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈和第二鏈cDNA，末端修復(fù)，3’末端加上堿基“A”，接頭連接，PCR 富集，經(jīng)文庫(kù)質(zhì)量控制，在HiSeq 平臺(tái)上測(cè)序。

基因序列組裝及序列比對(duì)：對(duì)cDNA 文庫(kù)測(cè)序得到的數(shù)據(jù)為原始數(shù)據(jù)raw data，進(jìn)一步過(guò)濾掉質(zhì)量不好的reads 后，得到的數(shù)據(jù)為clean reads，再利用StringTie[26]軟件對(duì)比對(duì)上的reads 進(jìn)行組裝，通過(guò)比對(duì)效率，可以評(píng)估所選參考基因組組裝是否能滿(mǎn)足信息分析的需求。StringTie 是基于最優(yōu)化理論建立的算法,利用比對(duì)信息構(gòu)建多可變剪切圖譜,運(yùn)用構(gòu)建流量網(wǎng)絡(luò),從而根據(jù)最大流量算法來(lái)對(duì)reads 進(jìn)行組裝和評(píng)估其表達(dá)量。同Cufflinks 等其他軟件相比,該軟件可以構(gòu)建更完整的轉(zhuǎn)錄本和更好的評(píng)估表達(dá)量。

新基因功能注釋?zhuān)菏褂肂LAST[27]軟件將發(fā)掘的新基因與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KOG、Pfam、KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，使用KOBAS2.0 得到新基因的KEGG Orthology 結(jié)果，預(yù)測(cè)完新基因的氨基酸序列后使用HMMER 軟件與Pfam 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，獲得新基因的注釋信息。

差異表達(dá)基因分析：在兩個(gè)不同條件下，表達(dá)水平存在顯著差異的基因或轉(zhuǎn)錄本，稱(chēng)為差異表達(dá)基因（DEG）或差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄本（DET）。差異表達(dá)分析得到的基因集合叫做差異表達(dá)基因集，用“A_vs_B”的方式命名。根據(jù)兩（組）樣品間表達(dá)水平的相對(duì)高低，差異表達(dá)基因可以劃分為上調(diào)基因（Up-regulated Gene）和下調(diào)基因（Down-regulated Gene）。上調(diào)基因在樣品（組）B 中的表達(dá)水平高于樣品（組）A 中的表達(dá)水平，反之為下調(diào)基因，上調(diào)和下調(diào)是相對(duì)的，由所給A 和B 的順序決定。篩選條件為log2FC≥2 且FDR＜0.01。對(duì)篩選出的差異表達(dá)基因做GO 功能分析和KEGG 通路分析[28,29]。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：提取顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉肌肉組織的總RNA，再反轉(zhuǎn)錄cDNA，隨機(jī)選取4 個(gè)差異表達(dá)基因，設(shè)計(jì)引物，以cDNA 為模板，β-肌動(dòng)蛋白（beta-actin）作為內(nèi)參基因，對(duì)顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 驗(yàn)證，按照Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（TaKaRa）熒光定量PCR 試劑盒進(jìn)行，每個(gè)試驗(yàn)樣品檢測(cè)3 次，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉肌肉轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

經(jīng)測(cè)序，6 個(gè)樣品共獲得Clean Data 52.67 Gb，每個(gè)樣品平均6.32 Gb。Clean Data 質(zhì)量值大于或等于30 的堿基所占的百分比都在94.16%及以上。Clean Data 中G 和C 兩種堿基占總堿基的百分比在48%以上，與參考基因組的比對(duì)效率從77.44%到81.67%不等（表1）。

表1 顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉肌肉轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果Tab.1 The results of muscle transcriptome sequencing for the carp with microinjection of Chinese shrimp DNA

2.2 差異表達(dá)分析

通過(guò)與鯉參考基因組（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/GCA_000951615.2）的序列比對(duì)，共檢測(cè)到417 個(gè)差異基因，其中上調(diào)基因246 個(gè)，下調(diào)基因171 個(gè)。圖1 中的每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)基因，上調(diào)差異表達(dá)基因?yàn)榧t點(diǎn)，下調(diào)差異表達(dá)基因?yàn)榫G點(diǎn)，非差異表達(dá)基因?yàn)楹邳c(diǎn)。橫坐標(biāo)表示某一個(gè)基因在兩樣品中表達(dá)量差異倍數(shù)的對(duì)數(shù)值；縱坐標(biāo)表示基因表達(dá)量變化的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性的負(fù)對(duì)數(shù)值。

圖1 顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉差異表達(dá)火山圖Fig.1 The volcano plot of differentially expressed genes obtained from the carp with microinjection of Chinese shrimp DNA

2.3 表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本GO 注釋

對(duì)于已表達(dá)的基因進(jìn)行GO 功能分類(lèi)，共有12 995 個(gè)轉(zhuǎn)錄本可比對(duì)至GO 數(shù)據(jù)庫(kù)，其中8 835個(gè)轉(zhuǎn)錄本與代表紅色部分的生物過(guò)程（Biological Process）相關(guān)，1 119 個(gè)轉(zhuǎn)錄本與代表綠色部分細(xì)胞組成（Cellular Component）相關(guān)，3 041 個(gè)轉(zhuǎn)錄本與代表藍(lán)色部分的分子功能Molecular Function）相關(guān)。圖2 中的縱坐標(biāo)：左邊代表基因數(shù)目所占百分比，右邊代表基因數(shù)目；橫坐標(biāo)：代表GO 分類(lèi)。

圖2 顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉基因的GO 功能分類(lèi)Fig.2 Gene ontology analysis for the differentially expressed genes obtained from the carp with microinjection of Chinese shrimp DNA

2.4 表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本KEGG pathway 注釋

為了進(jìn)一步了解轉(zhuǎn)錄本的生物學(xué)功能，進(jìn)行KEGG 代謝通路注釋。共有241 968 個(gè)轉(zhuǎn)錄本比對(duì)到273 個(gè)KEGG代謝通路中。其中，對(duì)照魚(yú)為121 413個(gè)（對(duì)照魚(yú)1 為41 044 個(gè)，對(duì)照魚(yú)2 為40 259 個(gè)，對(duì)照魚(yú)3 為40 110 個(gè)），實(shí)驗(yàn)魚(yú)為120 555 個(gè)（實(shí)驗(yàn)魚(yú)1 為39 680 個(gè)，實(shí)驗(yàn)魚(yú)2 為41 643 個(gè)，實(shí)驗(yàn)魚(yú)3為39 234 個(gè)）。圖3 中橫坐標(biāo)為富集因子（Enrichment Factor），縱坐標(biāo)表示通路名稱(chēng)，圖3 中每一個(gè)圓表示一個(gè)KEGG 通路。

圖3 顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉差異表達(dá)基因KEGG 通路富集分析結(jié)果Fig.3 KEGG enrichment analysis for the differentially expressed genes obtained from the carp with microinjection of Chinese shrimp DNA

2.5 RT-PCR 分析

為了驗(yàn)證結(jié)果的可靠性，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析中，選出c7950（蘇氨酸脫水酶）上調(diào)基因和c41918（氨甲酰基-磷酸合成酶）、c39168（乙胺基轉(zhuǎn)移酶）、c39902（脯氨酰4-羥化酶）等4 個(gè)下調(diào)基因，進(jìn)行了RT-PCR 檢測(cè)。結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果一致。在氨基酸代謝通路中，由于所關(guān)注的c41918 基因的下調(diào)，可使天門(mén)冬氨酸、丙氨酸和谷氨酸含量增加；而c39902 基因在精氨酸和脯氨酸代謝代謝通路中，下調(diào)導(dǎo)致脯氨酸積累。圖4 中這兩個(gè)基因都低于對(duì)照組，表明基因是下調(diào)的。

圖4 顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉差異表達(dá)量分析圖Fig.4 Differential expression analysis for the genes obtained from the carp with microinjection of Chinese shrimp DNA

3 討論

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的優(yōu)點(diǎn)不僅是檢測(cè)范圍廣泛（如不同的環(huán)境條件、每個(gè)物種的不同發(fā)育階段等），而且也是篩選差異表達(dá)基因和挖掘功能基因的重要手段[30]。有關(guān)鯉轉(zhuǎn)錄組研究已有報(bào)道，如劉思嘉等[31]比較研究了松浦鏡鯉（Songpu mirror carp）及荷包紅鯉（Cyprinus carpio Red var.vuyuanensis）的轉(zhuǎn)錄組，檢測(cè)了兩種魚(yú)在低溫環(huán)境條件下的表達(dá)基因的差異，通過(guò)對(duì)相關(guān)基因在耐受低溫環(huán)境條件下與信號(hào)通路參與的評(píng)定，探索了兩種魚(yú)在低溫條件下的分子調(diào)控機(jī)制；趙剛等[32]對(duì)巖原鯉（Procypris rabaudi）轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測(cè)序，獲得了許多轉(zhuǎn)錄組信息，為巖原鯉在抗病性、遺傳育種和資源恢復(fù)上提供了幫助；Liang 等[33]對(duì)黑龍江野鯉（Cyprinus haematopteru）進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究，發(fā)現(xiàn)參與蛋白定位、蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、蛋白加工、內(nèi)吞作用、胰島素、溶酶體和生物節(jié)律調(diào)控等相關(guān)代謝通路的低溫響應(yīng)基因被顯著富集；王蘭梅等[34]分析了生長(zhǎng)速率不同的福瑞鯉2 號(hào)（freshwater fisheries research center,FFRC 2 strain）肌肉組織的轉(zhuǎn)錄組，比較分析了福瑞鯉2 號(hào)的2 個(gè)轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)，鑒定出了mb、myl2b、fhl1、tnni1、pdk2 和lamb3 等6 個(gè)魚(yú)肌肉生長(zhǎng)相關(guān)的關(guān)鍵基因,這一發(fā)現(xiàn)也為魚(yú)類(lèi)新品種優(yōu)良生長(zhǎng)性狀以及后續(xù)的基因功能研究奠定了基礎(chǔ)。這些研究主要是鯉在低溫下分子調(diào)控機(jī)制和在抗逆性狀上的轉(zhuǎn)錄組分析方面的報(bào)道，而基于對(duì)鯉品質(zhì)性狀的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究少有報(bào)道。目前，為了能在顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉中找到可控制高氨基酸性狀的基因，本實(shí)驗(yàn)室在對(duì)顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉的外源基因檢測(cè)、氨基酸和蛋白質(zhì)含量的測(cè)定以及重金屬含量的測(cè)定等方面做了大量的工作[13,14]。在此基礎(chǔ)上，本研究對(duì)顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，旨在挖掘與鯉氨基酸相關(guān)的基因。在測(cè)序前，檢測(cè)了測(cè)序樣本外源基因和氨基酸，選出已整合外源基因且氨基酸總量高的顯微介導(dǎo)的中國(guó)對(duì)蝦基因鯉和對(duì)照鯉各3尾用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，利用生物信息學(xué)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果6 個(gè)樣品測(cè)序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)量控制后，共得到52.67 Gb 的有效數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了10 634 個(gè)新基因。經(jīng)GO 功能富集與KEGG Pathway 顯著性富集分析，共篩選出差異基因417 個(gè)，其中246 個(gè)上調(diào)基因，171 個(gè)下調(diào)基因。進(jìn)一步分析中發(fā)現(xiàn)18 個(gè)差異表達(dá)基因與氨基酸相關(guān)，其中14 個(gè)下調(diào)基因（Down-regulated Gene），4 個(gè)上調(diào)基因（Up-regulated Gene），下調(diào)基因要多于上調(diào)基因。這些基因主要遍及在組氨酸代謝，色氨酸，精氨酸，絡(luò)氨酸等9 個(gè)氨基酸代謝通路上。分析中還發(fā)現(xiàn)，氨甲酰-磷酸合成酶（carbamoyl-phosphate synthetase 2，CPS2）酶基因和脯氨酰4-羥化酶（prolyl 4-hydroxylase，P4H）基因在氨基酸代謝通路中能引起氨基酸含量升高。

本研究在肌肉組織中篩選到的氨基甲酰磷酸合成酶是催化谷氨酰胺、ATP 和碳酸根合成氨甲酰磷酸的酶。它參與生物體內(nèi)嘧啶核苷酸的合成，是維持生物生理活動(dòng)的一種重要酶[35]。而催化氨基甲酰磷酸（carbamyl phosphate）生成的酶，有兩種分型，分別為氨基甲酰磷酸合成酶Ⅰ（carbamoyl phosphate synthetase I,CPS-I）和氨基甲酰磷酸合成酶2（carbamoyl phosphate synthetase 2,CPS-2）。而氨基甲酰磷酸合成酶2（carbamoyl phosphate synthetase 2,CPS-2）存在于各種細(xì)胞的細(xì)胞液中，用谷氨酰胺為原料，合成嘧啶。在氨基酸代謝通路中，首先CPS2在丙氨酸，天門(mén)冬氨酸和谷氨酸代謝通路中有兩個(gè)功能：一是催化天門(mén)冬氨酸（L-Aspartale）合成天門(mén)冬氨基甲酰（N-carbamoyl,L-Aspartale）。該基因在所有的轉(zhuǎn)基因鯉中均表達(dá)下調(diào)（19.4 倍），就會(huì)導(dǎo)致天門(mén)冬氨酸（L-Aspartale）增加，進(jìn)而導(dǎo)致丙氨酸（L-Alaming）的增加；另一個(gè)功能是導(dǎo)致谷氨酸（L-Glutamate）的增加，在該通路中原本是催化谷氨酸合成產(chǎn)生氨甲酰磷酸，谷氨酸減少，但由于該基因是下調(diào)基因，產(chǎn)物變少，谷氨酸含量增加；其次CPS2 在魚(yú)類(lèi)上的另一個(gè)作用是可以將氨轉(zhuǎn)換成魚(yú)類(lèi)的主要排泄物尿素，在排氨和排尿素兩種排氮的廢物方式上，顯然是直接排氨更省能量，最終對(duì)生長(zhǎng)也有力。因此CPS2 基因不僅在代謝通路上可使天門(mén)冬氨酸、丙氨酸和谷氨酸增加，也可起到幫助魚(yú)類(lèi)生長(zhǎng)的作用。另外，脯氨酰4-羥化酶基因在精氨酸和脯氨酸代謝（Arginine and proline metabolism）通路中，由于下調(diào)（下調(diào)3.5 倍），導(dǎo)致脯氨酸積累。該基因使脯氨酸（probine）向下代謝的三個(gè)酶表達(dá)下調(diào)，脯氨酸積累。結(jié)果表明，CPS2 和P4H 在基因鯉中雖然都表達(dá)下調(diào)，但都在氨基酸代謝通路中引起氨基酸含量的升高。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)獲得了顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉與對(duì)照鯉的轉(zhuǎn)錄組信息，并通過(guò)生物信息學(xué)進(jìn)行了差異分析。測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6 個(gè)樣本的測(cè)序質(zhì)量值Q30 堿基百分比在94.0%以上，說(shuō)明測(cè)序質(zhì)量較好。對(duì)顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉與對(duì)照鯉的差異表達(dá)基因進(jìn)行了分析，在氨基酸代謝通路上發(fā)現(xiàn)了與氨基酸相關(guān)的一些差異基因。這些基因是否就是隨機(jī)轉(zhuǎn)入鯉中的對(duì)蝦DNA 片段所帶來(lái)，還有待于進(jìn)一步研究。從轉(zhuǎn)錄組的分析結(jié)果可知，導(dǎo)入的外源對(duì)蝦基因可能參與了一些蛋白質(zhì)合成與分解等代謝過(guò)程的信號(hào)通路，從而影響到顯微介導(dǎo)中國(guó)明對(duì)蝦基因鯉的蛋白質(zhì)組成，最終影響顯微介導(dǎo)中國(guó)明對(duì)蝦基因鯉氨基酸的變化。當(dāng)然，本實(shí)驗(yàn)所獲得的結(jié)果也說(shuō)明，對(duì)蝦基因的導(dǎo)入對(duì)顯微介導(dǎo)中國(guó)對(duì)蝦基因鯉的影響也可能不僅是影響單個(gè)或幾個(gè)信號(hào)通路，而是在接納對(duì)蝦基因后使得整個(gè)機(jī)體發(fā)生了一系列更為精細(xì)而復(fù)雜的代謝變化，這些都還有待于繼續(xù)深入的研究。進(jìn)一步從基因表達(dá)和基因調(diào)控等分子水平研究對(duì)照鯉和轉(zhuǎn)基因鯉的差異，不僅有助于深入理解其品質(zhì)的差異，也有助于更加深入地認(rèn)識(shí)氨基酸和脂肪酸等一系列代謝過(guò)程[14]。鯉的品質(zhì)性狀是鯉生產(chǎn)的重要研究方向，提升鯉品質(zhì)的遺傳改良已成為首要環(huán)節(jié)。發(fā)現(xiàn)和利用優(yōu)質(zhì)鯉品種的遺傳資源，篩選和鑒定控制鯉品質(zhì)性狀的功能基因，闡明品質(zhì)性狀形成的分子調(diào)控機(jī)理，是現(xiàn)代生物技術(shù)與傳統(tǒng)方法共同改良鯉品質(zhì)的新方法和新途徑，對(duì)提高鯉品質(zhì)性狀具有重要意義。在研究中發(fā)現(xiàn)的一些基因在影響鯉的氨基酸變化中存在一定的相關(guān)性，這為本研究提供了重要的參考依據(jù)。