pi RNA 調節心血管疾病的分子機制進展

謝金鑫楊子江王紅云肖俊杰

(1.上海大學生命科學學院心血管研究所,上海 200444;2.上海大學醫學院上海器官修復工程技術研究中心,上海 200444)

非編碼RNA是指無法翻譯蛋白質產物的核糖核酸分子.PIWI-interacting RNA(piRNA)是一類長度約30 nt的內源性非編碼RNA,能特異性地與動物細胞中Argonaute蛋白的類似物PIWI結合[1].piRNA最初是從生殖系細胞中發現的非編碼RNA[1-2],其5’端具有較強的鳥苷酸傾向[3].已有越來越多的研究發現,piRNA實際上在其他細胞(如心臟細胞)中表達[4].阿根廷的科學家使用H9多能干細胞來源的小RNA測序數據,鑒定出171個在心肌細胞中表達的piRNA,并提出心臟樣本中含有piRNA轉錄本的基因與心臟的關鍵生物學過程(如收縮和心肌發育)有關.這些piRNA可能在多能干細胞向心肌細胞分化相關基因的表達中發揮作用[5].此外,也有證據表明piRNA可以作為心血管疾病(cardiovascular disease,CVD)診斷的標志物以及治療的靶點[6].然而,關于心血管疾病中piRNA的作用及分子機制仍有待進一步發掘.本工作基于piRNA的生物發生過程,深入討論了其在不同心血管疾病中的作用及潛在機制,歸納了可以用于防治及診斷心血管疾病的piRNA發明專利,以期豐富piRNA的基礎理論,并為心血管疾病的防治提供新思路.

1 piRNA的生物合成與功能

piRNA與以往廣泛研究的siRNA、miRNA在起源、結構、效應蛋白等方面存在差異,具體包括:①siRNA與miRNA的產生均是由雙鏈RNA(double stranded RNA,dsRNA)經RNaseIII家族中Dicer酶剪切而來;piRNA的生物發生一般來源于piRNA簇,且不需要Dicer酶的切割,而是通過一些獨特的生物過程合成;②piRNA和siRNA/miRNA的效應蛋白不同,前者需要與PIWI蛋白結合發揮作用,后者則與Argonaute家族的Ago蛋白成員結合[7].

piRNA的生物合成過程中存在初級piRNA(primary piRNA)和次級piRNA(secondary piRNA).首先由基因組中的piRNA簇轉錄出長的單鏈RNA[3].然后可能受到線粒體外膜上有絲分裂內切酶的作用,5’端裂解產生初級piRNA[8-10].之后,該初級piRNA與PIWI蛋白結合.PIWI蛋白指導前體piRNA轉錄本的逐步片段化,產生階段性前體piRNA的尾頭串.與此同時,該前體piRNA的3’端會被單鏈RNA核酸外切酶Trimmer剪切為成熟長度[11-12],同時被甲基轉移酶催化發生2’-O-甲基化[13-15].在這個過程中,由piRNA引導的靶轉錄物產生含有5’單磷酸的RNA片段,作為pre-piRNA與PIWI蛋白結合,最終生成一個新的次級piRNA.該次級piRNA與產生它的piRNA具有10個nt的互補性,因此又可以作為靶向初級piRNA前體轉錄物以生成更多的次級piRNA,該過程被稱為“乒乓機制”[16],也是目前較為主流的piRNA生成機制.之后,來自馬薩諸塞大學醫學院的Gainetdinov等[17]提出了一種新的普適型模型來解釋多數動物體內piRNA生成的分子機制,即piRNA通過引導PIWI蛋白對前體轉錄物進行切割來啟動piRNA的產生.

值得注意的是,目前已在不同物種中鑒定出多種PIWI蛋白家族成員.果蠅中包含PIWI、Aubergine和Argonaute RISC catalytic component 3(Ago3)[18].小鼠中包含MIWI-Like(MILI)、Mouse PIWI(MIWI)和Mouse PIWI2(MIWI2)[19].人體中包含HIWILike(HILI)、HIWI1 Human(PIWI1)、HIWI2 Human(PIWI2)和Human PIWI3(HIWI3)[20].

已有研究發現,piRNA在機體內發揮著重要的作用.除了參與生殖系統轉座子沉默之外,piRNA還對維持干細胞功能、基因表達具有重要的調節作用[21],其中piRNA在基因表達表觀遺傳調控中的作用越來越受到關注[22-23].現已證實,piRNA廣泛參與了表觀遺傳調控[24],可以通過調控多種甲基化酶(DNA甲基化酶、RNA甲基化酶)參與生理病理進程.piRNA/PIWI復合物可募集DNA甲基轉移酶(methyltransferase,DNMT)來調節CpG位點甲基化,從而改變其轉錄活性[25].piRNA還可以調控DNA甲基轉移酶3B(DNMT3B)、DNA甲基轉移酶3A(DNMT3A)的活性,從而參與調節癌癥及神經系統疾病[26-27].在免疫發育過程中,piRNA能夠通過甲基化調控殺傷性免疫球蛋白樣受體(killer immunoglobulin-like receptors,KIR)的轉錄沉默[28].piRNA也能夠調控RNA甲基化酶從而參與表觀遺傳調控.例如,在彌漫性大B細胞淋巴瘤轉移過程中,piRNA-30473能通過上調甲基化酶WTAP(Wilms tumor 1-associated protein,Wilms腫瘤1相關蛋白)提高m6A水平,從而發揮其致癌作用[29].綜上可見,piRNA在DNA、RNA的甲基化調控方面發揮著重要作用.

2 piRNA在心血管疾病中的作用和機制

piRNA在心血管系統中發揮著重要的調節作用,如心力衰竭、心臟缺血再灌注損傷、心肌肥大和肺動脈高壓等.因此,基于多種疾病模型發掘出來的piRNA或許可以成為心血管疾病治療的新靶點(見圖1、表1).

表1 心血管疾病中的潛在piRNA靶點Table 1 Potential piRNA targets in CVD

2.1 piRNA與心力衰竭

與正常人相比,心力衰竭患者血樣中piRNA-6426的表達顯著下調.相應地,過表達piRNA-6426能夠抑制低氧誘導的心肌細胞紊亂和心力衰竭.具體機制如下:piRNA-6426能夠增強DNMT3B的活性,進而招募DNMT3B引起甾醇o-酰基轉移酶1(sterol oacyltransferase 1,SOAT1)啟動子區域的甲基化.高水平的SOAT1甲基化能夠緩解低氧誘導的心肌細胞凋亡[30].

細胞外囊泡(extracellular vesicles,EV)是機體內廣泛存在、可由多種細胞分泌的低免疫原性囊泡分子,可以攜載蛋白質、核酸分子等介導細胞與細胞間對話[38-39].已有研究發現,EV-piRNA在心力衰竭中可能發揮著一定的調節作用.有研究表明,在心力衰竭病人和健康人的血液樣本中,EV包裹的piRNA存在極不相同的表達譜[31].EV-piRNA的測序結果顯示,與健康人相比,心力衰竭患者血清中表達上調的piRNA有585個,表達下調的有4 623個,其中EV-piR-020009和EV-piR-006426的下調幅度最大.這暗示心力衰竭患者血清中的EV-piRNA可能是心力衰竭的潛在生物診斷標志物.

病理性心肌肥厚是心臟超負荷時發生的一種損傷反應,主要表現為心肌細胞體積增大、心肌細胞丟失等,可引起心力衰竭[40-41].piRNA可以調控蛋白激酶AKT(protein kinase B)的信號通路,從而參與調控細胞凋亡及心肌細胞肥大[42].Gao等[36]以8～10周齡的雄性C57BL/6為研究對象,建立了主動脈弓縮窄術(transverse aortic constriction,TAC)誘導的病理性心肌肥厚模型,鑒定出了一種心肌肥大相關的piRNA——CHAPIR,可以促進病理性肥大和心臟重塑.CHAPIR缺失能夠顯著減輕心臟肥大并恢復心臟功能,其分子機制如下:CHAPIRPIWIL4復合物直接與甲基化酶METTL3相互作用并阻斷下游靶基因轉錄物的m6A甲基化,從而上調靶基因多腺苷二磷酸多聚酶PARP10的表達.PARP10的CHAPIR依賴性增加會抑制絲氨酸蛋白激酶GSK3β的激酶活性,從而導致病理性肥大的進展.該研究揭示了piRNA介導的RNA表觀遺傳學機制參與了心臟肥大的調節,并且CHAPIR-METTL3-PARP10信號可作為治療病理性肥大和適應性不良心臟重塑的靶點.

2.2 piRNA與缺血性心肌病

piR-10555(DQ542443)在成年小鼠心臟缺血再灌注損傷模型中起到了重要的調節作用[32].首先,抑制piR-10555能夠阻斷過氧化氫誘導的心肌細胞凋亡.其次,運用基因敲除技術(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated nuclease9,CRISPR/Cas9)將piR-10555敲除后發現,piR-10555的缺失能夠有效緩解缺血再灌注引起的心肌損傷和細胞凋亡,其中涉及的機制如下:piR-10555可以與N-乙酰轉移酶(Nacetyltransferase 10,NAT10)直接結合,從而調控后者的乙酰化酶活,最終靶向下游基因,參與缺血再灌注引起的心肌細胞凋亡.

Rajan等[33]對心肌梗死患者和健康志愿者的樣本進行了piRNA測序及分析.結果發現,心肌梗死患者的piR-2106027水平顯著升高,并且與心肌肌鈣蛋白cTnI水平存在相關性.這說明,通過分析血清中piRNA的表達對心肌梗死的診斷和治療具有一定的臨床意義.

2.3 piRNA與肺動脈高壓

EV-piRNA被證實與肺動脈高壓存在一定的相關性.Lipps等[34]從23例慢性血栓栓塞性肺動脈高壓(chronicthromboembolism pulmonary hypertension,CTEPH)患者和23例對照者的血清中分離EV.通過測序及驗證,最終鑒定出21個差異化表達的piRNA或piRNA簇.生物信息學分析預測這些差異化表達的piRNA對心臟和血管重塑的進展有貢獻,其中DQ593039的表達水平與臨床有意義的參數相關,如平均肺動脈壓、肺血管阻力、右心室收縮壓和N-末端腦鈉肽前體水平.該研究結果表明,EV衍生的piRNA DQ593039(piR-hsa-23317)是肺動脈高壓的潛在生物標記物.這一發現證實了piRNA可作為心臟病潛在生物標志物,并有望在今后的臨床診斷中發揮作用.

此外,Ma等[35]在成年Wistar雄性大鼠中建立了缺氧誘導的肺動脈高壓模型.結果發現,缺氧會引起piRNA-63076的表達上升,進而引起酰基輔酶A脫氫酶啟動子區域的DNA甲基化,最終引起肺動脈平滑肌細胞增殖.這暗示了piRNA在肺動脈高壓的發生發展過程中起到了重要的調控作用.

2.4 piRNA與動脈粥樣硬化

目前,關于piRNA直接調控動脈粥樣硬化的文獻報道較少,piRNA在動脈粥樣硬化發生發展中的功能及作用機制有待闡明.Li等[6]的研究發現,在癌癥發展的血管生成過程中,在間充質干細胞的生理活性、表觀遺傳調控等中均有piRNA的參與.這說明piRNA可能間接參與了動脈粥樣硬化相關的病理過程.因此,通過對piRNA的分析可以作為對動脈粥樣硬化的一種新的診斷和治療策略.

2.5 piRNA與血管重構

血管重構是一項較為復雜的生理病理過程,關于其調控機制的研究具有重要的科學價值.在血管重構過程中,可能涉及內皮、血管平滑肌細胞、外膜成纖維細胞及其細胞外基質等眾多環節.piRNA可以廣泛參與上述過程從而調控血管生成.Lipps等[34]的臨床研究表明,piRNA或許可以靶向調控參與主動脈發育、冠狀動脈血管發育和心臟間隔發育過程的基因,如ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif 6(ADAMTS6)等.此外,piRNA已被證實可以直接調控肺動脈高壓過程中的血管重構過程(詳見2.3節).

3 與心血管系統piRNA相關的藥物開發及疾病診斷專利

作為診斷標準物,快速、穩定、高效以及低成本完成樣本檢測非常重要.piRNA在臨床疾病診斷方面展現出了顯著的優勢.

已有的對于包含piRNA在內的小RNA的檢測方法有Northern Blot、RNA凝膠印跡等[43],其中在臨床檢測以及實驗室相對定量時主要采用實時定量逆轉錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)的方法[44].例如,在評估胃癌患者外周血中的循環腫瘤細胞時,可以通過RT-PCR的方法檢測外周血中piR-651和piR-823的表達水平來實現[45].檢測的快速有效使得piRNA作為疾病診斷的標志物具有顯著優勢.例如,在診斷肺動脈高壓疾病尤其是當患者存在肺動脈擴大或右室功能障礙時,需要在超聲心動的基礎上,進一步分析N-末端前腦利鈉肽(N-terminal pro-B type natriuretic peptide,NTproBNP)、右心房壓(right atrial pressure,RAP)和混合靜脈血氧飽和度(oxygen saturation of mixed venose blood,SvO2)峰值等參數.然而這些參數的獲得相對復雜[46-47],因此,發掘新的血清生物標志物(如piRNA)將促使疾病的診斷更為快速、高效.

隨著piRNA研究的不斷深入,以piRNA為研究對象的專利與日俱增.截至2022年7月,從Web of Science中檢索關于心血管piRNA的相關專利達9項(見表2),包含診斷、分子藥物開發等方面.這預示著該領域有著極大的研究空間和轉化潛能.

表2 與心血管系統piRNA相關的藥物開發及疾病診斷專利Table 2 Drug development and diagnosis patents of piRNA in CVD

(1)制備與心臟病(例如肥厚性心肌病、心肌纖維化、冠心病、心肌梗死或心力衰竭)相關的產品,用于預防和/或治療心臟病的藥物開發(專利號:CN111705061-B).2020年的一項發明專利開發的是與piRNA-P1反義核苷酸相關的產品技術.有研究發現,在心臟組織和心肌細胞發生死亡時,piRNA-P1會顯著上調.piRNA-P1過表達會加劇心肌細胞的死亡,因此,開發與下調piRNA-P1表達水平相關的技術對抑制心肌細胞死亡具有重要意義.

(2)預防和治療心臟肥大、心肌纖維化、冠心病和心力衰竭的藥物組合物,包括PIWI相互作用RNA過表達載體、病毒(專利號:CN104548136-B).該專利開發的藥物組合物基于piR-mmu-7332(ugguaaacaaauaaucugcgcaugugccaa)進行相關病毒載體的開發,并最終以粉劑或片劑的形式投入應用,具有環保、經濟、易于制備、藥理可靠性和廣泛適用性等特點.

(3)檢測、預測、診斷、鑒別或治療心臟病(即心肌梗死)的藥物或試劑盒(專利號:CN106916885-B).該專利基于16個piRNA進行可以區分正常心臟組織和心臟病組織的試劑盒開發(探針組合物),其中包含piRNA在心肌梗死中的作用及分子機制.這一專利為心肌梗死的預防和診斷提供了思路,并將piRNA開發為治療心臟病的藥物.

(4)PIWI相互作用RNA在制備診斷和/或預測心臟病試劑盒中的應用(專利號:CN107447019-A).piRNA-12(uggaagacugauuguu)有助于誘導血管平滑肌細胞凋亡.piRNA-12抑制劑可用作生物標記物和血管平滑肌細胞凋亡的抑制劑.該專利是基于piRNA-12進行診斷和/或預測心臟病相關的試劑盒開發,具體包含可用于特異性檢測piRNA-12的引物、可用于制備預防和/或治療心臟病的藥物——piRNA-12抑制劑的開發.

(5)檢測急性心肌缺血性疾病的piRNA組合物(專利號:107151695-B).該專利基于4個piRNA序列中的兩個或更多個進行piRNA組合物開發,可用于檢測急性心肌缺血性疾病,并區分健康心臟和缺血心臟,具體包括:①檢測piRNA組成的方法,包括通過逆轉錄PCR、實時定量PCR、Northern雜交、芯片檢測等方法和測序方法檢測組成;②包含核苷酸序列的引物集;③用于區分正常和急性心肌缺血的試劑盒.

(6)開發piRNA類似物,作為用于心臟病診斷和/或預后評估的潛在藥物(專利號:CN110229879-A).該專利以piRNA-500(cguucaacugcuguucacauggaaccc)為靶點設計生物活性功能片段及其變體,用于心臟病(心臟肥大、心肌纖維化、冠心病、心肌炎、心臟瓣膜病、高血壓和/或心力衰竭)診斷和/或預后評估等,具體包括:①用于心臟病診斷和/或預后評估的藥物,包括上述piRNA-500核苷酸類似物、生物活性功能片段和/或其變體;②用于心臟病診斷和/或預后評估的試劑盒,包括用于特異性檢測piRNA-500核苷酸類似物的引物;③包含piRNA-500反義核苷酸的用途,用于制備預防和/或治療心臟病的產品.

(7)基于新發現的血樣分子標記物hsa-piR-009228、hsa-piR-016659和hsa-piR-020496開發用于唇腭裂、神經管畸形和先天性心臟病胎兒非侵入性產前診斷的新分子標記物(專利號:CN111944894-A).該專利可用于制備產前篩查、早期預警、臨床診斷和生物化學檢測產品,具體包括:①檢測唇腭裂、神經管畸形和先天性心臟病胎兒的分子標記物;②用于唇腭裂、神經管畸形和先天性心臟病產前篩查、預警和診斷的工具,包括用于先天性心臟病無創產前診斷的分子標記物的表達.

(8)piRNA核苷酸類似物及其反義核苷酸在制備用于診斷和/或預后評估心臟疾病的產品中的應用(專利號:CN107604058-B).該專利基于心肌細胞肥大模型,發現piRNA-514表達顯著下調,而過表達piRNA-514(aaucagauuugcaccacucaucuugguga)能顯著抑制異丙腎上腺素((isoproternol,ISO)誘導的心肌細胞肥大.通過檢測外周血血漿中piRNA-514的表達水平診斷心臟疾病,并對其預后評估提供參考,具體包括:①用于心臟病診斷和/或預后評估的藥物,包括有效劑量的piRNA-514核苷酸類似物或生物活性功能片段或其變體;②用于心臟病診斷和/或預后評估的試劑盒;③用于預防和/或治療心臟病的藥物等.

(9)piRNA及其反義核苷酸在診斷、預防、治療、預后評估缺血性心臟疾病中的用途(專利號:CN107385033-B).在缺血性心肌損傷及雙氧水誘導的心肌細胞凋亡過程中,piRNA-5938的表達上調.基于此,該專利設計出piRNA-5938的抑制物,通過轉染該試劑來抑制piRNA-5938的表達,最終抑制心肌細胞凋亡.該專利提示,piRNA-5938可以作為一種新的生物標志物應用于缺血性心臟疾病的診斷和/或預后評估,其反義核苷酸也可以作為一種新型的藥物用于缺血性心臟疾病的預防和/或治療.

4 展望

本工作討論了piRNA的生物發生過程,及其在心血管疾病中的診斷潛力,同時歸納了其作為分子靶點開展藥物開發的相關專利,為今后piRNA在心血管系統中的研究指明了方向,對相關心血管疾病的防治提供了新的思路.整體而言,目前對于piRNA在心血管系統中的作用及分子機制的研究處于起步階段,需開展更多的研究來充分闡明piRNA的表達及其調控機制,后續也仍有極大的空間有待挖掘.此外,臨床樣本中關于piRNA的研究尚需進一步擴大,以便更好地為疾病診斷開發新的方法.值得注意的是,基于EV-piRNA開展心血管疾病防治策略的開發將是該領域的重要發展方向.本工作對已報道的piRNA在心血管疾病中的作用及機制的闡述能夠豐富piRNA的分子生物學知識,為其在心血管疾病診斷和治療中發揮更強功能提供依據.