細胞初級纖毛在骨代謝中的作用及機制研究進展

胡小江 張宏其 郭超峰 唐明星 劉少華 李艷冰 張廣 李石磊 李韜 高琪樂*

1.中南大學湘雅醫院脊柱外科和骨科，湖南 長沙 410008 2.中南大學湘雅醫院檢驗科，湖南 長沙 410008

1 初級纖毛與骨質疏松

初級纖毛是細胞表面的一種以微管為基礎的纖細的細胞器，存在于單細胞真核生物和人類等脊椎動物的細胞中[1]。纖毛與質膜之間有連續的膜將其連接在一起，但纖毛由獨特的脂質和受體組成，使纖毛能夠檢測細胞外環境的變化，并向細胞傳遞信號，以調節細胞的多種生理過程。因此，原發性纖毛功能障礙會導致一組稱為纖毛病的綜合性疾病，在胚胎發育及個體生長中會影響許多不同的器官和系統，與其相關疾病包括肥胖、心血管和腎臟疾病、聽力和視力喪失，甚至癌癥等。目前，在這個領域內研究較廣泛的疾病為腎囊腫、肝囊腫以及骨質疏松[2-3]。

骨質疏松癥是一種因為骨量減低、骨組織微結構退化導致骨骼脆性增加的全身性骨骼疾病，通常會引起骨折風險增加，是老年人骨折最常見的原因[4]。最新的研究表明，婦女絕經后體內雌激素缺乏引起的骨質疏松與骨細胞初級纖毛結構的破壞緊密相關[5-6]。初級纖毛與骨質疏松、骨代謝之間存在密切的聯系[7-10]。

2 初級纖毛調節骨代謝的相關信號通路

初級纖毛是許多信號通路的信號傳導中樞，例如酪氨酸激酶受體(RTK)、轉化生長因子-β(TGF-β)通路、G蛋白偶聯受體(GPCRs)、Hedgehog/(Wnt)通路、Notch通路等，同時初級纖毛也是雷帕霉素的機制靶點(mTOR)[11]。以上通路均參與了機體骨代謝過程，現將研究較多的通路分述如下。

2.1 Hedgehog信號通路

Hedgehog信號通路是最早被發現的與初級纖毛信號傳導相關的通路，具有調節細胞增值分化和凋亡的功能[12]。研究發現，絕經后雌激素缺乏導致的骨質疏松與初級纖毛和Hedgehog信號通路有關：雌激素撤退導致骨細胞表面的初級纖毛伸長，從而引起骨細胞中Hedgehog信號通路的表達增加。骨細胞的Hedgehog信號可以通過增加RANKL/OPG等信號促進破骨細胞的生成[5]。最新的研究發現了存在于初級纖毛中的成骨細胞Hedgehog通路的負性調控因子SLITRK5，在細胞實驗中，成骨細胞SLITRK5的缺失導致Hedgehog信號通路的表達上調，而SLITRK5的過表達則會抑制Hedgehog信號通路的表達。其機制是Hedgehog通路的表達可以使細胞上初級纖毛數量增多，而SLITRK5是Hedgehog通路的負性調控因子，其低表達或者缺失會使Hedgehog通路表達上調[13]。

2.2 WNT信號通路

Wnt信號在間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的維持和分化中起著至關重要的作用。由Wnt控制的信號通路可分為典型(β-連環蛋白通路)和非典型(平面細胞極性和Wnt/Ca2+通路)兩類，依賴于β-連環蛋白穩定的Wnt通路被稱為WNT/β-連環蛋白通路，具有調節干細胞的增值和分化的作用[11]。但對于這個領域的研究一直以來存在很多矛盾和分歧：Corbit等[14]在2008年的研究結果顯示原發性纖毛缺失或破壞可導致WNT/β-連環蛋白通路活性上調；Bernatik等[15]在2021年的研究發現，在使用WNT激活劑(WNT3a)激活該通路條件下細胞初級纖毛的數量、長度相對于阻斷該通路的細胞初級纖毛無明顯差異，這表明WNT/β-連環蛋白通路的上調對初級纖毛形成沒有明顯作用。Bernatik等[15]的研究與之前研究結果的差異可能的原因有幾個方面：①此研究是使用新型的重組WNT3a激活了WNT/β-連環蛋白通路，而之前的研究中經常使用的是WNT3a條件培養基。WNT/β-連環蛋白通路的完全激活、初級纖毛形成通常發生在適當刺激后的幾個小時內，而細胞在WNT3a條件培養基中培養需較長時間，而此研究均在72 h內完成。②一些文獻報道的纖毛長度或厚度的變化實際上是通過乙酰化α-微管蛋白抗體染色觀察纖毛微管蛋白乙酰化的變化，現有證據表明纖毛微管蛋白在纖毛各個部位的表達具有顯著差異，不能準確測定纖毛的長度，而Bernatik等[15]是通過對Arl13b染色來觀察纖毛，Arl13b是一種來自Arf/Arl家族的小GTP酶，在纖毛膜中高度富集，可用于直接測定的纖毛的大小。雖然WNT通路對于初級纖毛不具有調節作用，但大量研究表明，初級纖毛對WNT通路具有顯著的調控作用[16-17]。

2.3 TGF-β信號通路

轉化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β超家族有幾十個成員，其中比較常見的包括TGF-β1/2/3、骨形態發生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)，它們都具有相同結構——一個疏水信號序列、一個結構域和一個成熟的C末端結構域。這個超家族所有成員對細胞的增值分化和胚胎發育都具有重要作用[18]。

MSCs的募集是組織發育、維持和修復的關鍵過程。TGF-β是一種有效的趨化因子，對骨髓間充質干細胞(BMSCs)的募集至關重要，在干細胞增殖和分化中起著關鍵作用。初級纖毛是BMSCs中TGF-β信號通路激活所必需的，根據免疫熒光結果表明，TGF-β受體、SMAD2、SMAD3和SMAD4都主要定位于BMSCs的初級纖毛，進一步的實驗驗證了這一結果。人為敲低調控纖毛產生的基因IFT88后可見纖毛長度變小的同時磷酸化SMAD2/3的水平也顯著降低。另外，IFT88基因敲低后BMSCs的遷徙能力降低，表明初級纖毛在骨骼疾病的發生機制中具有關鍵作用[19]。對于成骨細胞來說，現有的研究結果表明，TGF-β1通過HDAC6基因介導初級纖毛縮短和變形以及纖毛數量的減少；TGF-β通過失活骨形態發生蛋白BMP2和BMP7(誘導成骨細胞分化的主要蛋白)抑制成骨細胞的成熟和分化[20]。在另外的研究中表明，TGF-β對于纖毛的抑制作用是通過抑制IFT88基因的表達來實現的[21]。總之，TGF-β對于骨代謝的影響呈現兩面性，一方面通過激活BMSCs初級纖毛中的TGF-β/SMAD信號通路促進BMSCs的募集從而促進成骨，另一方面通過調控各基因的表達使初級纖毛變形、減少、功能減退，從而使得成骨細胞成骨分化受到抑制。對于TGF-β在成骨方面的兩面性目前尚未研究透徹，這也是目前骨代謝方面研究的重點方向。

此外，最新的文獻報道了中心粒附屬器蛋白CEP128，CEP128的缺失可在不影響初級纖毛結構和數量的基礎上導致斑馬魚細胞的初級纖毛中TGF-β/骨形態發生蛋白(BMP)信號通路功能受損，原因可能與纖毛上部分囊泡轉運缺陷有關[22]。因此CEP128可能會成為初級纖毛研究的新方向。

3 初級纖毛基因水平的調控對骨代謝的影響

3.1 IFT80

纖毛內轉運蛋白(IFT)是一系列維持纖毛結構和功能的蛋白。IFT以及調節的基因的缺失將會導致纖毛結構的破壞和功能缺失。Liu等[23]在對小鼠的動物實驗中，利用他莫昔芬(tamoxifen)誘導構建條件敲除IFT80的小鼠股骨骨折模型，與對照組相比，實驗組小鼠骨折愈合處骨體積、骨小梁數量和骨小梁厚度顯著降低，骨小梁間距更大。與對照組小鼠相比，骨細胞中IFT80的缺失導致骨折骨痂中纖毛形成受損和軟骨細胞增殖減慢。在對于椎間盤退變的機制研究中表明，IFT80的缺失導致椎間盤細胞凋亡顯著增加，并顯著降低軟骨形成標志物(Ⅱ型膠原蛋白、SOX9、蛋白聚糖和Hedgehog信號成分等)的表達，IFT80對于維持椎間盤細胞組織結構和功能具有重大作用。

3.2 IFT88

IFT88是纖毛內轉運復合物B的中心成分，對于纖毛的構建至關重要。前述已提到IFT88基因調控纖毛的產生和其功能的發揮，且這一過程與TGF-β有關。需要注意的是，IFT88缺失能夠顯著減弱細胞的遷徙能力，但關于IFT88如何影響細胞遷徙的機制還需要在后續的研究中進一步深入探討[24]。直到2020年Lee等[25]的研究表明，骨橋蛋白(OPN)是 BMSCs 向骨重塑部位遷移的重要化學引誘劑。初級纖毛的缺失減少了 OPN 介導的 BMSCs 遷移，初級纖毛作為 OPN 的化學引誘物傳感器，不僅通過控制 CD44 介導的 OPN 信號傳導，還通過控制Cdc42介導的肌動蛋白細胞骨架重排來調節BMSCs遷移。

3.3 KIF3A

順行纖毛內轉運運動蛋白KIF3A可調節初級纖毛的完整性和各種細胞功能。Jiang等[26]研究表明，KIF3A在人牙髓細胞中的表達被敲低后，導致初級纖毛數量顯著減少，從而導致大量成骨分化相關標志物的表達受損，Wnt3a/β-catenin的表達水平減弱。由于KIF3A完全不表達的小鼠胚胎無法繼續發育，因此，Qiu等[27]的研究中建立了以骨鈣素(Oc)-Cre介導小鼠部分KIF3A的條件性缺失的模型，成骨細胞中Oc-Cre介導小鼠KIF3A的條件性缺失減少了初級纖毛的產生和功能，并通過多種途徑損害成骨細胞介導的骨形成，包括骨鈣素減少、Hedgehog介導的Gli2表達減少、Wnt3a介導的β-連環蛋白和Axin2表達減弱。

4 初級纖毛調節BMSCs成骨分化

骨髓間充質干細胞是研究最廣泛的成骨細胞祖細胞來源，它在體外可以根據生物物理信號進行成骨細胞分化，這些生物物理信號包括生理循環靜水壓、流體流動產生的剪切應力、骨基質形變和剛度和電磁場等，初級纖毛在BMSCs在生物物理信號的接受和傳遞中具有重大作用。此外，機械刺激也能增加骨細胞和成骨細胞上初級纖毛的數量，且能通過骨細胞和成骨細胞中的初級纖毛依賴性和 Gli-1 依賴性途徑調節成骨反應[28]。骨細胞上的初級纖毛比BMSCs上的纖毛更容易感受到微弱的機械刺激[29]。

機械敏感鈣通道瞬時受體電位亞家族第四成員(TRPV4)在BMSCs中主要表達在初級纖毛上。使用TRPV4特異性拮抗劑GSK205拮抗TRPV4會導致BMSCs中振蕩流體剪切誘導的鈣信號完全喪失；使用TRPV4特異性激動劑GSK101可以誘導產生與振蕩流體剪切力誘導的信號相似的鈣信號，TRPV4特異性激動劑GSK101對于骨代謝疾病應用的研究尚未見報道[30]。

BMSCs機械傳導的信號通路利用cAMP作為第二信使，這個第二信使是通過位于BMSC初級纖毛中的腺苷酸環化酶-6(AC-6)激活，這種機械傳導機制被證明可以作為治療靶點，cAMP信號可通過AC激活劑進行生物化學激活，來增強cAMP信號和早期成骨信號，是一種潛在的治療骨質疏松等疾病的方法[31]。

對骨骼的機械刺激是骨骼密度維持和結構穩定所必需的，其刺激可通過BMSCs、骨細胞、成骨細胞等細胞表面的初級纖毛所感受；BMSCs是成骨細胞的前體細胞，BMSCs功能的發揮與成骨密切相關[32]。以下將介紹3個研究較多的骨骼物理刺激信號，以總結BMSCs初級纖毛成骨的相關研究方法。

4.1 低強度機械刺激

Curtis等[33]發現，低強度機械刺激(LMMS)誘導的成骨與BMSCs密切相關。Coughlin等[34]使用生物反應器對小梁骨塊進行低強度機械刺激(以0.3×g的LMMS在30 Hz下刺激骨小梁體外骨塊)，結果表明從機械刺激組中獲取的BMSCs比對照組的BMSCs增值能力更強，而通過水合氯醛破壞細胞表面的初級纖毛后，發現兩組細胞的增值能力沒有顯著差異，這證明LMMS能促進成骨，且其成骨的促進作用與BMSCs表面的初級纖毛密切相關。

4.2 流體剪切應力

流體剪切應力在BMSCs中誘導成骨反應。其作用的應力大小、頻率和持續時間不同，誘導的成骨反應效力也不同。Chi等[35]通過測定短期流體流動刺激后成骨標志物Cox2、Runx2和OPN的mRNA表達，確定了在體外細胞實驗中BMSCs在2 Pa剪切幅度和2 Hz頻率的流體剪切應力下成骨基因的表達最穩定且較顯著上升。有足夠證據表明流體剪切應力信號是由BMSCs表面的初級纖毛接受并傳遞的，且這一效應是由TRPV4介導的[30]。

4.3 脈沖電磁場

脈沖電磁場(pulsed electromagnetic fields，PEMFs)是預防和治療骨質疏松癥的潛在治療方法，之前的研究結果表明，PEMFs通過激活骨形態發生蛋白BMP-Smad1/5/8信號，促進大鼠顱骨成骨細胞的成骨分化和成熟。PEMFs通過初級纖毛介導的BMP受體Ⅱ(BMPRⅡ)表達上調和隨后BMP-Smad1/5/8信號的激活，刺激成骨細胞的成骨分化和成熟[36]。最新的研究表明，極低頻脈沖電磁場(16 Hz)也增強了BMSCs細胞的TGF-β信號傳導，增加Smad2、3和7表達[37]。其他研究表明，脈沖電磁場也通過初級纖毛介導的COX2-PGE2通路信號傳導和EP4表達促進成骨[38]、通過成骨細胞表面的初級纖毛激活PI3K/AKT信號通路，進而促進骨形成活性和分化[39]。

5 臨床應用

近來，對初級纖毛和骨代謝的相關研究逐年增多，但對于其臨床應用轉化的研究才剛剛起步。目前，治療骨質疏松癥的新方向是通過靶向誘導成骨細胞及MSCs成骨分化，進而促進骨形成。在此過程中調控初級纖毛功能可作為靶向治療骨質疏松的一種潛在治療方式。例如，上文中提及的腺苷酸環化酶(AC)激動劑激活cAMP信號模擬機械刺激誘導成骨反應；TRPV4特異性激動劑GSK101可能用于模擬機械負荷的成骨作用；以及脈沖電磁場作用下的成骨誘導等都是致力于尋找初級纖毛靶向治療的可能性與可行性。

另外，藥物研究表明，氯化鋰(LiCl)和非諾多泮(fenoldopam)兩種藥物都增強了BMSCs表面的纖毛的數量和長度。且BMSCs的機械敏感性增加，導致成骨基因的表達上調，但較長時間使用氯化鋰會導致細胞活性的降低，所以氯化鋰不能用于纖毛的靶向治療；而非諾多泮在其使用的早期對于成骨是起到促進作用，而長時間的應用下并未發現其顯著的促進成骨作用，因此，非諾多泮調控初級纖毛靶向治療骨質疏松更具備可行性HEDGEHOG[40]。纖毛靶向藥物機制的研究尚剛起步，其臨床應用尚無報道，在未來，纖毛靶向藥物的前景如何還需要進一步探索。

綜上所述，對于初級纖毛的研究目前已有了較為深入的認識，尤其是其形態、功能的研究，以及基因調控方面的研究均已經比較完善。目前對初級纖毛的體外模型、體內模型的構建均有了一定程度的認識[41]。但是，初級纖毛功能的具體機制研究尚有分歧，尤其是初級纖毛通路的機制研究尚未完全明確；此外，對于初級纖毛臨床應用研究，尤其是骨質疏松方面的纖毛靶向治療也剛剛起步，但其可行性與運用前景仍然十分良好，可為骨質疏松的治療提供新的方向。