不同細胞源性外泌體在骨質疏松癥中的研究進展

張銳柳海平趙寧李愛強柴喜平

甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050

外泌體(Exosomes)是由多種細胞分泌的一種細胞外囊泡(EVs)，直徑為40～100 nm，與細胞具有相同的拓撲結構，內含豐富的蛋白質、脂質、核酸及糖綴合物，其包含一系列膜相關的高階寡聚蛋白復合物，表現出明顯的分子異質性，所具有的脂質雙分子層結構能夠輕松地與其他細胞的細胞膜融合，可以通過直接接觸、內分泌或旁分泌的方式將其內含的生物活性物質選擇性地傳遞進入靶細胞，實現細胞外基質的重塑及細胞間信號分子的傳遞。多項研究發現這種細胞間囊泡的運輸方式在人類健康和疾病的許多方面發揮著重要作用，包括發育、免疫、組織動態平衡、癌癥和退行性疾病[1-2]。近年來，多項研究發現不同細胞源性外泌體可以調節骨代謝，重建骨平衡，與骨質疏松癥(osteoporosis，OP)有著密切的關系[3]。本文意在對不同細胞源性外泌體與骨質疏松之間的關系及其治療OP的機制與可行性進行綜述，以期為外泌體在OP的基礎研究與臨床診療中提供參考。

1 外泌體與骨穩態

骨骼是人體的主要支撐框架，具有剛性及自我修復能力，它為軟器官提供保護，為負責造血和脂肪存儲的骨髓提供了穩定的環境[4]。同時，骨組織是一種代謝高度活躍的組織，處于不斷的生理活動中以去除舊的、受傷的骨，并新形成骨取代它，新形成的骨在促進或保持骨強度和適應不斷變化的生物力學方面具有更強的機械性能，健康的骨骼總是處于這種動態平衡狀態，隨著年齡的增長，當骨吸收大于骨形成時，這種動態平衡失調時就會導致OP等嚴重疾病[5]。而這種動態平衡即骨穩態主要受成骨細胞(osteocblast，OB)、破骨細胞(osteoclast，OC)、骨髓間充質干細胞(BMSCs)、內皮細胞等多種細胞的調控。

OB是位于骨表面的大型立方體細胞，調控成骨，促進骨基質合成和隨后的礦化；OC是一種來源于單核細胞/巨噬細胞譜系的大型多核細胞，能夠在吸收區分泌Cl-、H+、基質金屬蛋白酶(MMPs)和組織蛋白酶K(CtsK)來降解骨組織[6]；BMSCs是組織工程中最理想的種子細胞，在一定條件下可向成骨細胞定向分化，對于骨穩態的維持至關重要[7]；骨形成與骨微環境中的血管生成密切相關，而骨微環境中血管的生成需要多種內皮細胞與信號通路的參與[8]，因此內皮細胞參與了骨微環境穩態的維持。上述OB、OC、BMSCs及內皮細胞相互影響、相互調節，進而維持骨穩態，防治OP的發生。而細胞間信息相互交流的機制尚不清楚，傳統理論認為細胞通過旁分泌途徑分泌相關細胞因子而進行信息交流[9]。而外泌體是大多數細胞分泌的納米級囊泡，它們被脂質雙分子層包裹，并攜帶蛋白質、聚糖、脂質、DNA、RNA等生物分子，其被其他細胞吸收時，這些生物分子被轉移并影響受體細胞的表型，從而發揮效應[10]。作為細胞間交流和遺傳物質轉運的重要介質，近年來多項研究發現OB、OC、BMSCs及內皮細胞等多種細胞分泌的外泌體在維持骨穩態、防治OP方面發揮了重要的作用。

2 不同細胞源性外泌體與骨質疏松

2.1 BMSCs源性外泌體與OP

BMSCs分化方向在骨代謝中扮演著重要的角色，外因及信號處理過程如何調控其分化方向是目前研究的熱點，外泌體作為干細胞重要的旁分泌形式，可通過信號蛋白、RNA等物質調控BMSCs增殖和分化改善骨質疏松[11]。目前有多項研究報道，來源于BMSCs的外泌體(MSC-Exo)具有與BMSCs相似的功能，并且與BMSCs相比，MSC-Exo具有穩定性好、易保存、無免疫源性、易獲得、轉化方便等優點。因此具有上述特性的MSC-Exo可能是改善傳統BMSCs治療OP不足的理想替代品[12]。

研究發現，BMSCs來源的外泌體可通過多種信號通路來影響OP。絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)是存在于哺乳動物中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞外刺激到細胞核的重要信號轉導酶[13]。研究表明成骨細胞的基因表達和功能發揮與MAPK信號通路的刺激有關[14]，Zhao等[12]從大鼠骨髓中分離出MSC，提取MSCs衍生的外泌體(MSC-Exo)，而后將成骨細胞系的hFOB 1.19細胞作為研究對象，設立空白對照組、MSC-Exo干預組、MSC-Exo+JNK基因敲除組，結果顯示，MSC-Exo干預組細胞存活率及細胞周期明顯高于其他兩組，因此得出結論，MSC-Exo可通過MAPK信號通路促進hFOB 1.19細胞增殖，從而延緩骨質疏松的發展。Wnt/β-catenin信號通路是調節骨代謝的重要分子途徑[15]，Wnt信號的激活有助于成骨細胞介導的骨形成的骨量及強度的增加，因此，該通路對成骨細胞增殖及分化至關重要[16]。Zuo等[17]研究發現MSC-Exo可以減輕輻射誘導的大鼠骨丟失，機制可能與減輕氧化應激反應、加速DNA損傷修復、減少與抑制增殖和細胞衰老相關的蛋白以及通過激活Wnt/β-catenin通路恢復BMSCs成骨和成脂平衡相關。

核酸是外泌體的重要組成成分，包括mRNA、miRNA、lncRNA等[18]。其中miRNA是一類長17～24個核苷酸的非編碼微小RNA[19]，包裹在外泌體中的miRNA能夠被靶細胞攝取與靶mRNA 3’UTR結合，進而如同內源性的miRNA通過沉默靶基因而發揮其作用[20]。干細胞源性外泌體很大程度上是通過其攜帶的miRNA發揮成骨作用。Qiu等[21]研究發現BMSC來源的外泌體miR-150-3p能夠促進OB增殖和分化，機制與上調Runx2、成骨細胞特異性轉錄因子(Osterix)、堿性磷酸酶(ALP)及骨鈣素相關。Zhang等[22]發現MSC-Exo通過將miR-935傳遞到OB中抑制信號轉導與轉錄激活因子1(STAT1)，而STAT1沉默則促進了OB和礦化結節中的ALP活性，從而抑制骨質疏松。Wang等[23]研究發現在MSCs成骨分化過程中，分化晚期細胞分泌的外泌體中miR-31、miR-144和miR-221低表達有助于誘導成骨分化，而分化晚期外泌體中miR-21顯著增加，而miR-21可作用于成骨分化抑制因子Spry1和Sox2，另一方面miR-21可以通過調節PI3K-AKT-GSK3β通路，激活Runx2的表達而促進MSCs的成骨。lncRNA是長度大于200個核苷酸的長鏈非編碼RNA，現已成為MSCs成骨過程中的新型調節劑。miR-34c可通過靶向SATB2和Runx2因子及抑制Notch通路中的多種因子影響成骨細胞與破骨細胞，從而在骨穩態中起關鍵作用[24]。MALAT1是最早鑒定出與人類疾病相關的lncRNA之一[25]，Yang等[26]研究發現MALAT1通過OPG/RANKL通路調節骨溶解，其下調可抑制破骨細胞活性。Yang等[27]研究發現miR-34c逆轉了MALAT1的作用，SATB2逆轉了miR-34c的作用，而BMSCs衍生的外泌體MALAT1通過介導miR-34c/SATB2軸增強了骨質疏松小鼠的成骨細胞活性，可減輕骨質疏松。

綜上所述，骨髓間充質干細胞來源的外泌體不僅可以影響MAPK、Wnt/β-catenin等成骨相關信號通路，并且可通過其內含的miRNA、lncRNA等物質發揮調控BMSCs成骨分化的作用，從而減輕骨質疏松。

2.2 OB源性外泌體與OP

OB是骨微環境的重要組成細胞，可通過分泌外泌體參與調節成骨-破骨平衡。Ge等[28]對小鼠成骨細胞株MC3T3外泌體進行蛋白組學分析，發現1 069個蛋白質，進行功能富集分析發現，生物學過程主要集中在蛋白定位和細胞內信號通路，能夠促進MSCs成骨分化的Integrin信號通路和在骨代謝平衡中發揮重要作用的mTOR信號通路備受關注；而分子功能顯示在骨重塑中起重要作用的Rho GTP酶較為重要，這說明OB衍生的外泌體在成骨過程中發揮作用。研究[29]發現礦化前成骨細胞MC3T3-E1分泌的外泌體能夠促進骨髓基質細胞(ST2)向成骨細胞分化，機制可能與MC3T3-E1分泌的外泌體改變了ST2細胞miRNA表達，這些改變的miRNA協同抑制Axin1，上調β-catenin蛋白，從而激活Wnt/b-catenin途徑，刺激成骨分化。微環境由細胞外基質(ECM)和細胞分泌的外泌體及生長因子組成，Narayanan等[30]研究發現分化細胞的ECM調節干細胞的表型，而它們的外泌體包含控制干細胞分化表型的特異性指導因子(miRNA、RNA、蛋白質)，在帶有OB外泌體的成骨細胞或成脂細胞外基質上分化的hMSCs都顯示出成骨相關基因的表達，因此，在hMSCs譜系分化過程中，外泌體可能會覆蓋ECM介導的指示信號。

另有研究發現，OB源性外泌體可能與破骨細胞形成相關。Deng等[31]研究表明OB源性外泌體含有RANKL蛋白，并且能夠通過受體配體(RANKL-RANK)將其轉移至破骨細胞前體，刺激RANKL-RANK信號傳導，促進破骨細胞形成。研究[32]發現溶酶體膜蛋白-1陽性的成骨細胞外泌體攜帶了RANKL、骨保護素以及抗酒石酸酸性磷酸酶，從而促進破骨細胞形成。

因此，OB源性外泌體不僅可以加強成骨細胞的分化和礦化，并且含有控制干細胞表型的特異性指導因子，促使干細胞向成骨細胞分化，另一方面，OB源性外泌體與破骨細胞形成相關。而OB和OC之間這種外泌體介導的細胞間通訊可能代表了骨骼建模和重塑的新機制。

2.3 OC源性外泌體與OP

骨吸收由OC介導，OC是目前唯一明確有降解骨質功能的細胞，過度活躍的OC導致骨丟失和骨質疏松。因此在加強成骨作用的同時，如何調節OC的功能在防治OP方面十分重要。Li等[33]研究發現OC衍生的外泌體miR-214-3p可以充當細胞間信使以介導OC與OB的通訊，轉移至OB以抑制骨形成，基于此，OC中miR-214-3p的治療性抑制可能是逆轉已確診的OP的潛在骨合成代謝策略。Yang等[34]研究發現OC衍生的含有miR-23a-5P的外泌體可通過抑制Runx2和促進YAP1介導的MT1DP來抑制OB分化。成熟OC外泌體可抑制OB內Wnt/β-catenin信號通路，并誘導OB凋亡，促進OP的發展。Huynh等[35]報道了破骨細胞前體的外泌體有刺激破骨細胞成熟化的作用，然而通過對成熟破骨細胞的培養，卻發現其分泌的外泌體抑制了破骨細胞生成。因此破骨細胞介導的外泌體的作用可能是雙向的，其中的分子機制對OP的影響尚未明確，尚需進一步探究。

2.4 內皮細胞源性外泌體與OP

骨組織具有高度血管化的特點，骨內血管灌注不足與OP密切相關。新生血管不但能夠運送氧氣及重要營養物質，還可以加速細胞增殖及骨基質礦化[36]。研究[37]發現血管內皮組細胞衍生的含有miR-126的外泌體，可下調內皮細胞SPRED1基因表達，活化RAF/ERK1/2信號通路，促進血管內皮細胞增殖、遷移及血管生成。van Balkom等[38]研究發現內皮細胞釋放的含有miR-214的外泌體通過作用于相鄰內皮細胞，可抑制內皮細胞凋亡并促進其遷移，促進血管生成。

內皮細胞源性外泌體除了可以促進血管生成而在骨再生中發揮作用外，還可以抑制OC活性，治療骨質疏松。Song等[39]研究發現內皮細胞源性外泌體比OB及BMSCs源性外泌體具有更有效的骨靶向性，內皮細胞衍生的外泌體可抑制OC的活性，在去卵巢小鼠OP模型中可抑制骨質疏松，對外泌體miRNA測序發現miR-155可能具有治療OP的潛力。Yang等[40]研究發現血管內皮細胞衍生的外泌體可以通過抑制鐵蛋白依賴性鐵下垂治療糖皮質激素誘導的骨質疏松癥。但也有研究[41]發現老年骨質疏松患者內皮細胞源性外泌體含有miR-31，而miR-31作用于MSCs后成骨分化被抑制。因此內皮細胞源性外泌體對成骨和成血管的生理效應尚不清楚，仍有待研究。

3 總結與展望

OP是一種骨量減低和骨微結構破壞而易發生骨折的全身性骨骼疾病[42]。我國65歲以上人群OP患病率約為32%，由其導致的骨折發生率高達39%，預計2050年我國由OP引發的骨折人數將達599萬，而相應醫療支出將高達1 745億元，給家庭及社會造成了嚴重的經濟負擔[43]。研究發現其發病機制主要是骨形成與骨吸收呈負平衡，骨重建失衡造成骨丟失[44]。目前治療骨質疏松癥的藥物可分為抗吸收調節劑和合成代謝藥物，前者包括雌激素、雄激素受體調節劑、降鈣素和雙膦酸鹽，后者有特立帕肽，但是這些藥物通常會引起嚴重的不良反應。就特立帕肽而言，研究表明，77%服用20 μg的患者和78%服用40 μg的患者出現了關節痛、肌肉痙攣及疲勞等不良反應；長期使用雌激素會對大腦及子宮產生嚴重的不良反應；而長期降鈣素治療由于降鈣素循環抗體的產生可導致機體耐受；目前最常用的治療OP 的藥物雙膦酸鹽會出現胃腸道刺激、骨骼和關節疼痛及下頜骨壞死等并發癥[45]。因此，開發具有高骨靶向性和低毒性的藥物勢在必行。

外泌體是細胞間通訊的中心介質，通過將蛋白質、脂質及RNA傳送至鄰近或遠處靶細胞，形成了一套全新的細胞間信息傳遞系統，通過影響細胞的生理病理狀態與OP的發生及進程密切相關。MSC-Exo不僅可以影響MAPK、Wnt/β-catenin等成骨相關信號通路，并且可通過其內含的miRNA、lncRNA等物質發揮調控BMSCs成骨分化的作用，從而減輕骨質疏松；OB和OC源性外泌體介導的細胞間通訊可能代表了骨骼建模和重塑的新機制；而內皮細胞源性外泌體通過成骨與成血管生理效應可發揮防治OP的作用。因此不同細胞源性外泌體在OP的發生及進程中較為重要，研究其作用機制可為外泌體作為新的OP治療策略奠定理論基礎。

外泌體作為防治OP的新策略具有多種優勢。與傳統細胞療法相比，外泌體具有較高的安全性[46]，其可避免細胞移植引起的栓子、腫瘤等并發癥；與生物納米材料相比，外泌體生物相容性較高而細胞毒性更低；并且外泌體因其穿過細胞膜及血腦屏障的能力及可調節的靶向效率，成為了遞送藥物及基因的理想載體[47]。但是將外泌體應用于骨質疏松的治療還面臨許多難題，例如，如何大量高效地分離提純外泌體以及運輸儲存是一大難題；其次，如何使其準確定位到靶組織和靶細胞是臨床應用面臨的問題[48]。隨著對外泌體研究的不斷深入，將更系統更準確地了解其與靶細胞之間的信號機制，外泌體有望成為防治OP的具有良好前景的治療策略。