HS-SPME-GC-MS法測定川藏道地藥材手掌參揮發性成分

楊秋悅,徐立軍,楊 洋,羅影子,黃明進

(1.西藏藏醫藥大學,西藏 拉薩 850000；2.貴州大學 農學院/石斛研究院/貴州省藥用植物繁育與種植重點實驗室,貴州 貴陽 550025)

手掌參為蘭科植物手參(Gymnadeniaconopsea(L.)R.Br)的干燥根,因其地下根莖形似手掌而得名手掌參[1],又名藏三七、掌參、佛手參、手兒參或旺拉。在中國主要分布在四川、西藏、青海等地,除中國外,朝鮮半島、日本、俄羅斯、西伯利亞及歐洲一些國家均有分布[1]。手掌參具有補益氣血、生津止渴的功效,主治肺虛咳喘、虛勞消瘦和神經衰弱等,中醫臨床用于補腎益精、生津止渴、消瘀和理氣止痛[2]。此外,手掌參具有抗過敏、抗氧化作用[3]以及促進祖細胞增殖的作用[4]。固相微萃取擁有簡單便捷、費用較少、易于自動化等特色,且在萃取過程中不需要有機溶劑,可以和氣相色譜—質譜(GC-MS)直接聯用,具有集采樣、萃取、濃縮及進樣于一體的優點,被廣泛應用在農業[5]、食品和環境[6-7]等領域中。前人對手掌參的研究主要集中在其營養成分(糖、脂肪、蛋白質、粗纖維等)與藥用活性(抗氧化活性、延緩衰老等),目前還未有人對其揮發性成分進行研究,手掌參具有明顯的氣味,證明其揮發性成分含量較豐富,對此進行研究能更好的開發利用手掌參藥材,本試驗對7個(批)手掌參進行了揮發性成分的初步研究。采用頂空固相微萃取技術(HS-SPME)萃取手掌參藥材中的揮發性成分,利用氣相色譜-質譜(GC-MS)聯用技術對不同產地手掌參中的揮發性成分進行快速的定性、定量分析,采用主成分分析和聚類分析方法對獲得的數據進行統計,為了解手掌參藥材揮發性物質組成、評價藥材質量提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用手掌參樣品由西藏藏醫藥大學徐立軍教授采購并鑒定為蘭科植物手掌參(G.conopsea)的干燥根。共7個(批)樣品,按地理位置,自西向東分別采自西藏朗縣(Z1：經度93°40′,緯度29°30′)、西藏米林(Z2：經度94°13′,緯度29°13′)、西藏波密(Z3：經度95°45′,緯度29°52′)、西藏昌都(Z4：經度97°10′,緯度31°90′)、四川巴塘(Z5：經度99°60′,緯度30°00′)、四川理塘(Z6：經度100°16′,緯度30°00′)、四川阿壩(Z7：經度101°42′,緯度32°54′)。

1.2 試驗儀器

手動SPME進樣手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex萃取頭(美國 Supelco公司)、HP6890/5975C GC-MS聯用儀(美國安捷倫公司)、電子天平(JA2003N,上海菁海儀器有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1頂空固相微萃取(HS-SPME)

將不同產地手掌參粉碎后過40目篩,稱取混勻樣品4.4～6.6 g,置于10 mL固相微萃取儀采樣瓶中,插入裝有2 cm50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動進樣器,在65 ℃的平板加熱條件下頂空萃取60 min后,移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進樣口(溫度250 ℃)中,熱解析進樣。

1.3.2氣相色譜—質譜(GC-MS)分析

GC條件：色譜柱為Agilent HP-5MS(60 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細管柱,初始溫度50 ℃(保留2 min),以3.5 ℃/min升溫至160 ℃,再以10 ℃/min升溫至310 ℃,運行時間48.43 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純He(99.999%)；柱前壓16.79 psi,載氣流量1.0 mL/min,不分流,溶劑延遲時間3 min。

MS條件：離子源為EI源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發射電流34.6 μA；倍增器電壓1635 V；接口溫度280 ℃；質量范圍29～500 amu。

1.4 揮發性化合物定性定量分析

對總離子流圖中的各峰經質譜計算機數據系統檢索及核對Nist17和Wiley275標準質譜圖,確定揮發性化學成分,用峰面積歸一化法計算了各化學成分的相對質量分數。

1.5 統計學處理

采用SPSS 21.0軟件對不同產地手掌參樣品揮發性成分進行主成分分析[8-9]和聚類分析[10]。

2 結果與分析

2.1 HS-SPME-GC-MS結果分析

按1.4操作,得到7個(批)手掌參藥材揮發性成分總離子流圖(圖1)。采用峰面積歸一化法對揮發性成分進行分析,計算各揮發性成分在不同樣品揮發性成分中的相對百分含量,結果見表1。7個(批)手掌參藥材樣品共有成分為20種,其含量差異較大(表1)。不同樣品中檢測到的揮發性成分種類最少為28個,最多為60個(其中有3個成分未鑒定出是何物質),其成分類型主要為醛、醇、酮、酸、烷烴等。朗縣產地的手掌參樣品檢測出60種成分,其中1個成分未知；米林產地的手掌參樣品檢測出34種成分,其中1個成分未知；波密產地的手掌參樣品檢測出28種成分,其中1個成分未知；昌都產地的手掌參樣品中檢測鑒定出38種成分；巴塘產地的手掌參樣品檢測出37種成分,其中1個成分未知；理塘產地的手掌參樣品檢測出34種成分,其中1個成分未知；阿壩產地的手掌參樣品檢測出36種成分,其中1個成分未知。

注：a表示西藏朗縣；b表示西藏米林；c表示西藏波密；d表示西藏昌都；e表示四川巴塘；f表示四川理塘；g表示四川阿壩。圖1 不同產地手掌參揮發成分總離子流圖Fig.1 Total ion flow diagram of volatile components of G.conopsea from different producing areas

表1 不同產地手掌參樣品揮發性成分

續表1

2.2 對揮發性成分進行主成分分析

將數據進行主成分分析(PCA),由于變量太多,樣本量太少,無法構成正定矩陣,因此對其變量因子進行篩選,最終用茴香醚、壬醛、1-甲氧基-4-甲基-苯、鄰苯二甲酸二丁酯、乙酸、己醛6個揮發性成分建立7×6矩陣。將數據導入SPSS 21.0軟件,經降維因子分析后,提取特征值大于1的,只有2個主成分,且方差貢獻率小于80%,故手動提取3個主成分,累計方差貢獻率為89.94%(>85 %),可以反映不同產地手掌參樣品揮發性成分的大部分信息(表2)。通過因子載荷矩陣中主成分負荷向量計算因子得分系數,因子得分系數=矩陣各主成分負荷向量/各主成分特征值的平方根,表示各項指標變量與提取的公因子之間的關系(表3),在某一公因子上得分高,表明該指標與該公因子之間關系越密切。

由表3可得到,3個主成分的因子評價線性關系：

F1= 0.231X1-0.147X2-0.257X3+0.263X4-0.173X5+0.211X6

F2= -0.504X1-0.574X2+0.177X3+0.125X4+0.336X5+0.486X6

F3= 0.078X1+0.628X2-0.192X3+0.326X4+0.724X5+0.308X6

由上述公式算出各成分的F1、F2、F3值,綜合得分F由每個主成分對應的特征值占所提取主成分總特征值之和的比例作為權重計算主成分綜合模型：F=0.58565F1+0.17026F2+0.14344F3,見表4,計算因子得分可對樣本進行比較。

表4 不同產地手掌參樣品的主成分因子得分Tab.4 Principal component factor scores of G.conopsea samples from different origins

從表4中F因子值可知,手掌參的藥材質量為Z7>Z6>Z2>Z3>Z4>Z1>Z5,即四川阿壩>四川理塘>西藏米林>西藏波密>西藏昌都>西藏朗縣>四川巴塘,此結果基于提取茴香醚、壬醛、1-甲氧基-4-甲基-苯這3個成分代表手掌參揮發性總成分基礎上得出。

2.3對揮發性成分進行聚類分析

運用 SPSS 21.0 軟件,采用 Ward′s 聚類法,以Euclidean 距離為測度,以12個成分(乙醇、乙酸、己醛、2-戊基-呋喃、2-乙基己醇、對甲酚、3,4-二甲氧基甲苯、1-甲氧基-4-甲基-苯、茴香醚、鄰苯二甲酸二丁酯、E-2-辛烯醛、壬醛)為主要變量,對7個不同產地的手掌參樣品進行了聚類分析,結果如圖2所示。當歐氏距離為10時,7個樣品被聚為2類,產地為西藏米林、西藏波密、西藏昌都、四川巴塘、四川理塘、四川阿壩的聚為1類,產地為西藏朗縣的單獨聚為1類；當歐式距離為5時,7個樣品被分為3類,產地為西藏昌都、西藏米林、西藏波密、四川巴塘的聚為1類,產地為四川阿壩和四川理塘的聚為1類,產地為西藏朗縣的單獨聚為1類。由此可看出西藏朗縣所產的手掌參與其他產地的有明顯差異,在揮發性成分測定中此樣品揮發性成分最多,且有多個其他產地沒有檢測出的成分。根據地理位置判定,7個產地中,朗縣最靠近西邊,與其他產地的手掌參有明顯的差異,故而根據經度差異,可簡單分為94°E以西為一類,94°E以東為一類。西藏昌都和四川阿壩分屬于不同兩個省級行政區,但由于處在川藏交界,且經度相近,故2個手掌參樣品有很大相似性,可知手掌參的揮發性成分受地域影響大。

圖2 7個不同產地手掌參樣品的聚類分析Fig.2 Cluster analysis of seven G.conopsea samples from different origins

3 結論與討論

采用HS-SPME-GC-MS法對來自川藏7個(批)不同產地手掌參樣品的揮發性成分測定分析,共測定出70個成分,其中3個成分未能確定其構成,共有成分有20個,其中含量最多的是對甲酚,含量在57%～81%之間,其次為茴香醚和己醛,兩者差異不大,無法作為分辨指標。本試驗對手掌參藥材評價根據主成分分析,提取茴香醚、壬醛、1-甲氧基-4-甲基-苯這3個成分進行降維分析,得出四川阿壩>四川理塘>西藏米林>西藏波密>西藏昌都>西藏朗縣>四川巴塘這一結果,但由于樣品來源少且沒有同一產地不同批次的樣品,故此結果具局限性,只是對手掌參樣品揮發性成分的初步研究。日照是植物進行光合作用的必要條件,日照時數可能通過影響揮發性成分前體物質的供給而對揮發性成分的合成產生影響[11-12]。低溫或高溫會對植物細胞膜系統的穩定性造成破壞并誘導活性氧積累,從而誘導萜類、酚類等具有清除自由基等功能的次生代謝物的合成[13]。前人研究證明揮發性成分受日照、氣候等環境因子影響大,故測定結果具不穩定性。

與蘭科植物相比,手掌參與石斛花含有的相同揮發性成分有：己醛、苯甲醛、苯甲醇、壬醛、十四烷、十五烷、庚醛、2-庚酮、(Z)-2-庚烯醛、2-戊基呋喃、(E)-2-辛烯醛[14-16]；與天麻含有的相同揮發性成分：2-庚酮、苯甲醛、1-辛烯-3-醇、2-戊基呋喃、3-辛烯-2-酮、苯乙醛、庚醛、對甲酚、十五烷、十六烷、乙酸、己酸、戊醛[17-18]；與白芨花含有的相同揮發性成分：1-辛烯-3-醇、苯甲醇、戊醛、己醛、庚醛、壬醛、苯甲醛、十五烷、十六烷、對甲酚[19]?？梢?在蘭科植物的揮發性成分中,有許多共有成分,且多數為醛、酮類物質。

在這些揮發性成分中,對甲酚用于制染料、消毒藥、藥品、樹脂和增塑劑等[20]；茴香醚具有令人愉快的茴香樣香氣,用于有機合成,也用作溶劑、香料和驅蟲劑[21]；壬醛為無色油狀液體,具有玫瑰、柑橘等香氣,有強的油脂氣味[22]；己醛可用于調配蘋果、橙子、漿果、西瓜等食用香精[22]；鄰苯二甲酸二丁酯為增塑劑,對多種樹脂具有很強溶解力[23],由于手掌參含有這些成分故而其具有很濃厚且混合的味道。

試驗結果顯示川藏不同產地的手掌參有多種相同化學成分但含量差異大,由于揮發性成分受環境影響大,故在評價其品質時,應全面考察其指標成分,未來還可測定其他省份的手掌參樣品揮發性成分,以及不同收獲季節即不同批次的手掌參樣品進行更加深入的研究。