產體外抗鼻咽癌物質紅樹林土壤細菌篩選及其活性成分分析*

黃議瑩，李 喆，潘信利，黃媛林，胡文進，李 菲，王巧貞，黃庶識，周曉瑩，溫文勝**

(1.廣西醫科大學第一附屬醫院耳鼻咽喉頭頸外科，廣西南寧 530021；2.廣西科學院，廣西海洋天然產物與組合生物合成化學重點實驗室，廣西南寧 530007；3.廣西科學院，國家非糧生物質能源工程技術研究中心，非糧生物質酶解國家重點實驗室，廣西生物煉制重點實驗室，廣西生物質工程技術研究中心，廣西南寧 530007；4.廣西醫科大學生命科學研究院，廣西南寧 530021)

鼻咽癌(Nasopharyngeal Carcinoma,NPC)起源于鼻咽上皮，是中國南部高發的惡性腫瘤之一。目前，常見的鼻咽癌化療藥物有紫杉醇、順鉑、奈達鉑、吉西他濱、多西他賽等，靶向治療藥物有貝伐珠單抗、西妥昔單抗、舒尼替尼等。上述藥物對鼻咽癌細胞的控制雖然具有一定效果，但是均有不同程度的毒副作用，長期使用易產生耐藥性，影響病人的治療和康復。因此，尋找高效、低毒、有靶向性的抗癌藥物成為現在亟待解決的問題。

廣西紅樹林土壤富含作為微生物物質和能量來源的有機質，微生物資源豐富，而這些微生物為了適應高鹽、低溫、高濕度和強光照的極端紅樹林生境，進化出獨特的代謝路徑和產生具有生物學活性的物質[1]。迄今為止，已從廣西紅樹林生境中分離得到多株新菌，其中包含3個新屬和9個新種，分別屬于變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)[2]。此外，廣西紅樹林土壤來源的細菌已被證實具有多樣的生物學活性。黎芳婷等[3]從廣西3種紅樹植物及其根際土壤中分離得到4株具有抑制魚類鏈球菌病的致病菌。李菲等[4-6]研究結果證實了廣西紅樹林土壤、紅樹植物及其根際土壤來源的細菌能夠分泌多種功能酶，生產具有抗血栓活性和抗植物病原菌活性的物質，并使用特殊引物擴增驗證了15株內生菌株具有生產聚酮類和非核糖體肽類化合物的潛力。黃媛林等[7]通過活性篩選從一株廣西紅樹林土壤來源的鏈霉菌MCCG 2008中分離得到一個已知的抗腫瘤化合物放線菌素D，該化合物能夠殺死多種腫瘤細胞并已應用于臨床治療[8]。

前人對廣西紅樹林土壤來源的細菌的研究主要集中在多樣性分析、新種挖掘以及功能基因分析等，而對其所產活性化合物的報道較少。為從廣西北海紅樹林土壤中篩選出能夠產生抗鼻咽癌活性物質的可培養細菌，本研究擬使用鼻咽癌細胞株作為研究對象，采用細胞計數試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK8)法進行活性菌株的篩選，依據基因型和表型完成活性菌株的分類，應用活性測試追蹤法和柱層析分離對其所產生的活性次生代謝產物進行分離純化，評估活性化合物在體外對鼻咽癌細胞增殖的抑制能力，進一步擴展人們對廣西紅樹林細菌活性化合物生產潛力的認知，為開發潛在的抗鼻咽癌藥物提供結構模板。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品

樣品為廣西北海紅樹林保護區(108°31′25″ E， 21°53′15″ N)距離桐花樹根5 cm左右的土壤，樣品采集后使用密封袋密閉保存，并于72 h內稀釋涂布。

1.1.2 測試對象

使用的鼻咽癌細胞株TW03和5-8F為廣西醫科大學鼻咽癌實驗室長期保存。

1.1.3 培養基

細菌分離培養基參照李菲等[9]的方法進行配置，具體配方如下。添加甘油的酪氨酸瓊脂培養基：L-天門冬酰胺1.0 g，酪氨酸0.5 g，甘油10 mL，復合鹽母液10 mL，去離子水1 000 mL，瓊脂15.0 g，pH值7.2-7.4。淀粉葡萄糖瓊脂培養基：可溶性淀粉10.0 g，葡萄糖1.0 g，甘油10 mL，復合鹽母液10 mL，去離子水1 000 mL，瓊脂15.0 g，pH值7.2-7.4。葡萄糖酪素瓊脂培養基：葡萄糖10.0 g，水解酪素0.5 g，復合鹽母液10 mL，去離子水1 000 mL，瓊脂15.0 g，pH值7.2-7.4。燕麥培養基：粗燕麥粉20.0 g，復合鹽母液10 mL，去離子水1 000 mL，瓊脂15.0 g，pH值7.2-7.4。鏈霉菌瓊脂培養基2號(ISP2)：麥芽提取物2.0 g，葡萄糖2.0 g，酵母提取物2.0 g，去離子水1 000 mL，瓊脂15.0 g，pH值7.2-7.4。復合鹽母液：MgSO4·7H2O 0.5 g，KNO31.0 g，NaCl 0.5 g，K2HPO40.5 g，NH4NO30.1 g，FeSO40.01 g，MnCl2·4H2O 0.001 g，ZnSO4·7H2O 0.001 g，去離子水10 mL。

細菌保藏培養基：含30%(V∶V)甘油的ISP2液體培養基；Reasoner′s 2A (R2A)培養基。鼻咽癌細胞培養基：含10%胎牛血清(美國賽默飛世爾科技公司)以及1%青鏈霉素混合液(北京索萊寶科技有限公司)的高糖達爾伯克(氏)改良伊格爾(氏)培養基(DMEM,美國賽默飛世爾科技公司)。

1.1.4 儀器與設備

EVOQ液相色譜-質譜聯用儀(德國Bruker公司)，DD2核磁共振儀(美國安捷倫科技有限公司)，LRH-150F生化培養箱(上海齊欣科學儀器有限公司)，IS-RDV3立式恒溫振蕩器(蘇州捷美電子有限公司)，SW-CJ-2F潔凈工作臺(蘇州佳寶凈化工程設備有限公司)，WGL-230B熱電鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)，二氧化碳細胞培養箱(美國賽默飛世爾科技公司)，Multiskan GO plate reader多功能酶標儀 (美國賽默飛世爾科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 可培養細菌的分離純化

將新鮮采集的土壤平鋪于無菌培養皿中，放置于65℃鼓風干燥箱干燥30 min，稱取2.0 g樣品用20 mL無菌水稀釋制成土壤懸浮液，隨后經無菌水稀釋獲得10-2和10-3稀釋度的樣液。取200 μL的樣液分別接種于5種細菌分離培養基中，并涂布均勻，28℃下恒溫培養。待長出單菌落后，挑取菌落采用三區劃線法純化菌株，純化好的菌株轉移至含30% (V∶V)甘油的改良ISP2液體培養基凍存管中，于-80℃冷凍保藏。

1.2.2 篩選活性菌株

分離純化后的菌株分別接種于裝有200 mL R2A液體培養基的三角瓶中，在180 r/min、28℃條件下振蕩培養7 d。離心去除菌體，發酵上清液使用等體積的乙酸乙酯萃取3次后，減壓濃縮獲得發酵液粗提物。將粗提物溶解于二甲基亞砜(DMSO)并經無菌過濾器過濾制得1 mg/mL的無菌樣液。分別取對數生長期的鼻咽癌細胞株TW03和5-8F，用新鮮DMEM培養基配置成5×104個/mL的細胞懸液后接種于96孔板中，每孔加入細胞懸液100 μL，于37℃、5% CO2培養箱中過夜培養，待細胞貼壁后每孔加入樣液1 μL，同時取1 μL DMSO和1 mg/mL多柔比星分別作為陰性和陽性對照。96孔板在37℃ CO2培養箱中孵育24 h后，每孔加入10 μL 細胞計數試劑盒(Cell Counting Kit-8,CCK8)溶液，再繼續反應1.5 h，使用多功能酶標儀在450 nm處測量吸光值，細胞活力=(OD實驗組-OD空白)/(OD對照組-OD空白)×100%。每個樣品重復3次。

1.2.3 菌株的分類鑒定

使用Chelex-100樹脂法提取細菌DNA[10]，參照李菲等[11]的方法進行PCR擴增，各基因擴增所需引物見表1。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，委托北京擎科新業生物技術有限公司進行測序分析，所得序列使用Contigexpress拼接后獲得完整的16S rRNA、atpD和rpoB基因序列。為了尋找系統發育關系相近的菌株，將菌株的16S rRNA、atpD和rpoB基因序列以及16S rRNA+atpD+rpoB多基因序列提交至EzBiocloud server[12]和BLAST平臺進行匹配比對。選取有效基因序列在MEGA 7.0[13]軟件中使用最大似然(Maximum-likelihood)法或鄰接(Neighbor-joining)法構建系統發育樹，各分支置信值設為1 000次。

表1 細菌16S rRNA和看家基因序列的擴增及測序引物Table 1 Amplification and sequencing primers of bacterial 16S rRNA and housekeeping genes

1.2.4 菌株的形態學與生理生化鑒定

將菌株接種于ISP2固體培養基上，28℃恒溫培養7 d，觀察并記錄菌體形態特征。參照《鏈霉菌鑒定手冊》[15]和《放線菌的分類和鑒定》[16]中的方法，使用GEN Ⅲ MicroPlateTM測試板檢測菌株的碳源利用情況。參考張紀忠等[17]的方法對菌株進行硝酸鹽還原、明膠液化、葡萄糖分解實驗、產H2S及產酸能力的測試。

1.2.5 活性化合物的分離純化和結構鑒定

將10 mL活性菌株種子液接種至1 L的燕麥液體培養基中，共發酵10 L，在180 r/min、28℃條件下振蕩培養7 d。離心去除菌體，發酵上清液使用等體積的乙酸乙酯萃取3次，有機相濃縮干燥后得到發酵液粗提物(125.6 mg)。使用2.5 mL甲醇溶解粗提物后經硅膠柱層析分離，柱層析硅膠為100-200目，以乙酸乙酯∶甲醇(90∶1→0∶100)梯度洗脫，經薄層色譜(Thin Layer Chromatography,TLC)法檢識，合并相同組分，共得到19個洗脫組分，即Fr.1-Fr.19。各組分經旋轉蒸發濃縮后用DMSO溶解并經0.22 μm無菌微孔濾膜過濾制備樣品。使用CCK8法檢測各組分的活性，得到具有較強體外細胞毒性的組分，隨后使用核磁共振儀分析活性化合物的結構。

1.2.6 活性化合物的抗腫瘤活性評估

活性化合物使用DMSO溶解，含腫瘤細胞的96孔板制備及活性檢測方法參照1.2.2節，其中活性化合物的濃度梯度設置為0-16.9 μmol/L，以分析其對鼻咽癌細胞株TW03和5-8F的半抑制濃度(Half Inhibitory Concentration,IC50)。

2 結果與分析

2.1 活性菌株的系統發育分析

菌株的16S rRNA基因序列長度為1 341 bp，與已知的卡伍爾氏鏈霉菌StreptomycescavourensisNBRC 13026T的16S rRNA基因序列具有99.0%的相似性，而與其他鏈霉菌的相似性均低于98.8%，因此判定該菌株隸屬于鏈霉菌屬。由圖1和圖2可知，在以16S rRNA基于最大似然法和多基因序列(16S rRNA+atpD+rpoB)基于鄰接法構建的系統發育樹中，菌株MCCG 218與鏈霉菌屬的其他菌株聚集在一起，進一步驗證了該菌屬于鏈霉菌屬，命名為Streptomycessp.MCCG 218。

圖1 菌株MCCG 218基于16S rRNA基因序列的最大似然法系統發育關系分析Fig.1 Phylogenetic relationship analysis of strain MCCG 218 based on 16S rRNA gene sequence by maximum likelihood method

2.2 菌株MCCG 218的形態和生理生化分析

菌株MCCG 218在改良的ISP2固體培養基上培養5 d后，呈現出與鏈霉菌相似的形態特征，菌落小而致密，幼時表面光滑、邊緣整齊、不易挑起，繼而發展成絨毛狀，形成淺黃色、圓形的菌落(圖3)。生理生化特征測試表明，菌株MCCG 218能產生H2S，不能分解葡萄糖和液化明膠。菌株MCCG 218能利用果膠、L-乳酸、3-甲酰葡萄糖、D-果糖、L-組胺、黏液酸、乙酸、D-蘋果酸、奎寧酸、L-蘋果酸、D-甘露醇、β-甲酰-D-葡糖苷、N-乙酰-D-半乳糖胺、D-阿拉伯醇、D-乳酸甲酯、糖質酸、溴-丁二酸、糖質酸、溴-丁二酸和L-焦谷氨酸等作為碳源，其碳源利用能力與其最近親緣菌株S.cavourensisNBRC 13026T相似，都能利用果糖和葡萄糖作為碳源，但菌株MCCG 218不能分解甘油，而S.cavourensisNBRC 13026T能利用甘油作為碳源。

圖2 菌株MCCG 218基于多序列位點的鄰近系統發育關系分析Fig.2 Phylogenetic relationship analysis of adjacent system of strain MCCG 218 based on multiple sequence sites

圖3 菌株MCCG 218在改良的ISP2固體培養基上的菌落形態Fig.3 Colony morphology of strain MCCG 218 on the modified ISP2 solid culture medium

2.3 活性化合物的結構分析

活性化合物使用甲醇溶解后經800 MHz核磁共振波譜檢測，其核磁共振1H化學位移如表2所示。化合物1的同核位移相關譜中，H-12(δH6.43)、H-11(δH5.91)和H-13(δH5.34)顯現出相關性,推測其結構中含有共軛烯烴(圖4)。這些特征譜峰與已知的巴弗洛霉素A1的核磁圖譜相似[18]。然而化合物1的1H-NMR圖譜比已知巴弗洛霉素A1的圖譜多了一個位于δH6.06(J=10.7 Hz)的雙峰，并在COSY譜中顯示出了與δH2.82(m)的相關性，推測巴弗洛霉素A1中的羥基發生了還原反應生成了一個烯基。化合物1的H-24(δH1.88,1.26)在COSY譜中僅與CH3-25(δH0.85)相關，推斷為24位的亞甲基可能僅與一個甲基相連。這些特征峰顯示了化合物1與巴弗洛霉素A1的差異性，但與已知的巴弗洛霉素A1衍生物(17,18-dehydro-19,21-di-O-methyl-24-demethyl-bafilomycin A1)一致[19]，然而在該化合物的核磁共振氫譜圖中僅出現2個甲氧基的單峰(δH3.70和δH3.23)，因此推測該化合物應為無19和21位甲氧基取代的巴弗洛霉素A1衍生物(17,18-dehydro-24-demethyl-bafilomycin A1)。經HRESI-MS分析顯示化合物1m/z 591.3101 [M+H]+,表明該化合物的分子量為590，而巴弗洛霉素A1 (C35H58O9)的分子量為622.83，進一步驗證了化合物1為巴弗洛霉素A1衍生物C34H54O8(圖5)。

表2 化合物1的1H-NMR譜分析(CD3OD,800 MHz)Table 2 1H-NMR spectrum analysis of compound 1 derivative (CD3OD,800 MHz)

圖4 化合物 1的同核位移相關核磁圖(COSY,CD3OD)Fig.4 Homonuclear displacement-related nuclear magnetic diagram of compound 1 derivative (COSY,CD3OD)

圖5 化合物 1的化學結構Fig.5 Chemical structure of compound 1 derivative

2.4 活性化合物的抗腫瘤活性

活性化合物使用DMSO溶解后制成不同濃度的樣液，經CCK8法檢測發現巴弗洛霉素A1衍生物對鼻咽癌細胞株TW03和5-8F表現出較強的細胞毒性，IC50值分別為2.7 μmol/L和9.2 μmol/L。

3 討論

在過去的20多年里，多個研究小組從紅樹林來源的微生物中分離得到超過1 000種活性化合物，其中有10%來源于細菌，因此紅樹林微生物也被認為是理想的藥源菌[20]。本研究從廣西北海紅樹林土壤中分離篩選得到一株能夠產生體外抗鼻咽癌活性化合物的細菌MCCG 218，經以16S rRNA、atpD和rpoB基因序列開展的系統發育分析發現該菌歸屬于鏈霉菌屬，命名為Streptomycessp.MCCG 218。基于16S rRNA基因序列的比對發現，該菌株與卡伍爾氏鏈霉菌S.cavourensisNBRC 13026T具有最近的親緣關系，已知的卡伍爾氏鏈霉菌基因組中包含生產多種廣譜抗菌化合物的生物合成基因簇，如巴弗洛霉素D、Nonactic acid和Prelactone B等[21]。目前有多個課題組已從卡伍爾氏鏈霉菌的發酵液中分離得到多個具有抗腫瘤活性和廣譜抗菌活性的化合物[22]，如巴弗洛霉素B1、巴弗洛霉素C1、巴弗洛霉素D、二酮吡嗪類化合物、無活菌素(Nonactin)、單活菌素(Monactin)和二活菌素(Dinactin)等，推測與其具有高親緣性的菌株MCCG 218可能也具有生產這些活性次生代謝產物的能力。本研究通過化學分離和活性測試追蹤法從菌株MCCG 218的發酵液中分離得到一個活性化合物，經核磁和質譜檢測發現該活性化合物為巴弗洛霉素A1衍生物，該化合物的發現證實了MCCG 218與其親屬菌株卡伍爾氏鏈霉菌都具有生產巴弗洛霉素化合物的能力。

巴弗洛霉素是一類含有16元環骨架的多烯大環內酯類抗生素，迄今已有30多種巴弗洛霉素從鏈霉菌和北里孢菌(Kitasatospora)中分離得到[23]，該類化合物已被證實具有抗細菌、抗真菌、抗腫瘤、抗病毒和抗骨質疏松等活性[24]，但其抗鼻咽癌活性還未見報道。本研究明確了巴弗洛霉素A1衍生物對鼻咽癌細胞株TW03和5-8F的細胞毒性，其IC50值分別為2.7 μmol/L和9.2 μmol/L。雖然該類化合物有巨大的臨床應用潛力，但是其結構中包含多個手性中心和相似的官能團，化學合成路徑煩瑣，難以通過化學手段進行大規模生產[25]。而目前已報道的巴弗洛霉素生產菌都存在產量低且發酵生產成本高的缺點，不能滿足工業化和研究的需求。巴弗洛霉素生產菌MCCG 218的發現，為研究巴弗洛霉素生物合成相關基因的多樣性提供了材料，為進一步調控和優化巴弗洛霉素的生物合成以及鼻咽癌治療藥物的研發奠定了基礎。

4 結論

紅樹林孕育了多種新型微生物和植物，是生物活性天然產物的豐富來源。本研究從廣西紅樹林土壤中分離得到一株能夠生產具有體外抗鼻咽癌活性物質的鏈霉菌MCCG 218，并證明了該活性物質為巴弗洛霉素A1衍生物。鑒于巴弗洛霉素的廣譜抗菌性和較強的細胞毒性，該活性化合物的發現有望為鼻咽癌治療藥物的研發提供參考和模板。