苦杏仁苷對模型大鼠瘀熱互結(jié)證的改善作用*

黃全元，楊 斌，羅 俊，謝旭華，盧 曉，以 敏

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣西 南寧 530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)，廣西 南寧 530021；3.廣西壯族自治區(qū)柳州市工人醫(yī)院，廣西 柳州 545005）

瘀熱互結(jié)證是指火熱毒邪或兼夾痰濕壅于血分，搏血為瘀，致血熱、血瘀兩種病因互為搏結(jié)、相合為患而形成的一種證型［1］。瘀熱互結(jié)于皮膚，可見皮膚黏膜瘀斑、紅腫現(xiàn)象，體溫升高，凝血功能混亂；于肝臟，則導(dǎo)致肝臟功能受損［2-3］。苦杏仁苷是杏、桃、李子、蘋果、山楂、枇杷等薔薇科植物種仁中普遍存在的含氰基糖苷化合物［4］，能調(diào)血脂，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞作用，以減少斑塊數(shù)量，增加正常血管腔面積，抑制反饋性管腔增大［5］。苦杏仁苷可減輕腎損傷［6］，改善糖尿病腎病模型大鼠的過度氧化應(yīng)激、炎癥和腎組織纖維化［7］，還可減輕慢性胰腺炎模型大鼠胰腺纖維化程度，抑制白細(xì)胞介素1β（IL-1β）誘導(dǎo)的終板軟骨細(xì)胞變性，改善微循環(huán)并緩解血液停滯［8］。為此，本研究中利用大鼠瘀熱互結(jié)證模型，觀察不同劑量苦杏仁苷對其中醫(yī)體征、給藥后不同時(shí)間段的體溫、血小板、凝血指標(biāo)、肝腎功能等的影響。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與動(dòng)物

儀器：CA-1500型全自動(dòng)凝血分析儀［希森美康醫(yī)用電子（上海）有限公司］；XSP-8CE型生物光學(xué)顯微鏡（上海長方光學(xué)儀器有限公司）；7100型全自動(dòng)血生化分析儀（日本Hitachi公司）；MC-347型電子體溫計(jì)［歐姆龍（大連）有限公司］；SHANDON Excelsion型高級自動(dòng)組織脫水機(jī)（英國Shandon公司）；Thermo-Histocentre3型全自動(dòng)組織包埋機(jī)（美國Thermo公司）；Leica-RM2135型高級組織切片機(jī)（德國Leica公司）；漩渦混合器（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）。

試藥：苦杏仁苷（成都曼斯特生物科技有限公司，批號為MUST-17042810，純度≥98%）；阿司匹林腸溶片（廣東南國藥業(yè)有限公司，批號為170903）；角叉菜膠（美國Sigma公司，批號為CAS9000-07-1）；高活性干酵母（河北馬利食品有限公司，批號為20170704）；水合氯醛（成都市科隆化學(xué)品有限公司，批號為CAS302-17-0）；氯化鈉注射液（廣西裕源藥業(yè)有限公司，批號為R17080102）；白細(xì)胞介素6（IL-6）試劑盒（批號為T12017846）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（批號為S24017847），均購自武漢華美生物工程有限公司；丙二醛（MDA）試劑盒（批號為20180412）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號為20180412），均購自南京建成生物工程研究所；血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）試劑盒（上海源葉生物科技有限公司，批號為E20180501A）；Y9醇溶性伊紅（上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS，福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。

動(dòng)物：SPF級SD大鼠50只，雄性，8周，體質(zhì)量（210±20）g，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號SYXK（桂）2014-0003，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號SCXK（桂）2014-0002。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心倫理委員會批準(zhǔn)，于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［溫度（22±1）℃，相對濕度40%～70%］飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)。

1.2 方法

1.2.1 分組、給藥與建模

將50只SD大鼠分為正常對照組（尾靜脈注射等體積生理鹽水）、模型組（尾靜脈注射等體積生理鹽水）、阿司匹林組（灌胃100 mg/kg）及苦杏仁苷高、低劑量組（分別尾靜脈注射40 mg/kg、20 mg/kg），各10只。給予相應(yīng)藥物或生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。給藥第4天時(shí)，腹腔注射1%角叉菜膠溶液（每天1次，連續(xù)3 d），給藥第7天時(shí)皮下注射20%高活性干酵母溶液（10 mL/kg），以復(fù)制大鼠瘀熱互結(jié)證模型。

1.2.2 瘀熱互結(jié)證表征

注射干酵母溶液后6 h時(shí)，將大鼠置冷光源下觀察并評分。中醫(yī)表征評分標(biāo)準(zhǔn)：舌質(zhì)、眼睛、爪甲、尾部無明顯變化記0分；表現(xiàn)微紅、紅潤、瘀斑分別記1，2，3分；舌質(zhì)紅紫、眼睛紅紫、爪甲紅紫色、尾部出現(xiàn)明顯瘀斑記4分。

1.2.3 體溫測定

于注射干酵母溶液前2 h（基礎(chǔ)體溫）時(shí)及注射后1，2，3，4，5，6，7 h時(shí)測定大鼠體溫［9-10］，并計(jì)算各時(shí)點(diǎn)體溫與基礎(chǔ)體溫的差值。

1.2.4凝血指標(biāo)檢測

注射干酵母溶液后7 h時(shí)，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血5 mL，放入抗凝管（含肝素），搖勻，測定血小板計(jì)數(shù)（PLT）水平；腹主動(dòng)脈取血1.5 mL，并緩慢注入0.5 mL含109 mmol/L枸櫞酸鈉溶液的塑料管中并充分混勻，3 000 r/min離心15 min，取血漿，測定凝血四項(xiàng)指標(biāo)［凝血酶原時(shí)間（PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（APTT）、凝血酶時(shí)間（TT）及纖維蛋白原（Fib）］。

1.2.5 肝腎功能指標(biāo)檢測

注射干酵母溶液后7 h時(shí)，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血5 mL，室溫下放置2 h，10 000 r/min離心10 min，取上清液，測定堿性磷酸酶（ALP）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、血尿酸（UA）、尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）的水平。

1.2.6 腎臟病理形態(tài)觀察

取血后，迅速對大鼠剖腹，取兩側(cè)腎臟，用濾紙吸干腎表面血液后，去包膜稱定質(zhì)量并計(jì)算腎臟指數(shù)，固定于10%中性福爾馬林液（經(jīng)焦碳酸二乙酯處理）中浸泡1 h，常規(guī)脫水，石蠟包埋，切片（4～6 μm厚），用蘇木素-伊紅（HE）染色。采用顯微鏡采集病理圖像并分析，觀察腎小球、間質(zhì)血管是否充盈；系膜細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、腎小管結(jié)構(gòu)是否清晰；細(xì)胞質(zhì)豐富、紅染情況；間質(zhì)血管是否有擴(kuò)張、淤血，評分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 瘀熱互結(jié)證腎臟病理形態(tài)等級評分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Rating criteria of renal pathology of heat stagnation and blood stasis syndrome

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 瘀熱互結(jié)證表征評分

與正常對照組比較，模型組大鼠中醫(yī)表征評分顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，苦杏仁苷高、低劑量組和阿司匹林組大鼠中醫(yī)表征評分均顯著降低（P＜0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠中醫(yī)表征及腎臟指數(shù)和病理評分比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of TCM symptoms，kidney index and pathological score of rats in each group（±s，n=10）

表2 各組大鼠中醫(yī)表征及腎臟指數(shù)和病理評分比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of TCM symptoms，kidney index and pathological score of rats in each group（±s，n=10）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。表3至表5同。Note：Compared with those in the normal control group，*P＜0.05；compared with those in the model group，#P＜0.05（for Tab.2-5）.

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2.2 體溫

正常對照組大鼠體溫變化不大，溫度均差＜0.5℃。與正常對照組比較，模型組大鼠注射干酵母溶液后2，3，4，5，6，7 h時(shí)的體溫顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，阿司匹林組、苦杏仁苷高、低劑量組大鼠體溫在各時(shí)間點(diǎn)的變化幅度均有不同程度降低。詳見表3。

表3 各組大鼠體溫變化比較（±s，℃，n=10）Tab.3 Comparison of temperature changes of rats in each group（±s，℃，n=10）

表3 各組大鼠體溫變化比較（±s，℃，n=10）Tab.3 Comparison of temperature changes of rats in each group（±s，℃，n=10）

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2.3 腎臟病理形態(tài)變化

各組大鼠腎臟指數(shù)無顯著差異（P＞0.05）。與模型組比較，苦杏仁苷高劑量組大鼠病理評分顯著降低（P＜0.05）。詳見表2和圖1。

圖1 大鼠腎臟病理形態(tài)（HE，×200）A.Normal control group B.Model group C.Low-dose amygdalin group D.High-dose amygdalin group E.Aspirin group

2.4 凝血指標(biāo)

與正常對照組比較，模型組大鼠PLT和Fib水平均顯著升高，APTT，PT，TT均顯著縮短（P＜0.05）；與模型組比較，苦杏仁苷低劑量組大鼠APTT，PT，TT均顯著延長（P＜0.05），苦杏仁苷高劑量組大鼠PLT和Fib水平均顯著降低，APTT，PT，TT均顯著延長，阿司匹林組大鼠PLT水平顯著降低，APTT，PT，TT均顯著延長（P＜0.05）。詳見表4。

Fig.1 Pathological morphology of rat's kidney（HE，×200）表4各組大鼠凝血指標(biāo)比較（±s，n=10）Tab.4 Comparison of blood coagulation indexes of rats in each group（±s，n=10）

Fig.1 Pathological morphology of rat's kidney（HE，×200）表4各組大鼠凝血指標(biāo)比較（±s，n=10）Tab.4 Comparison of blood coagulation indexes of rats in each group（±s，n=10）

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2.5 肝腎功能指標(biāo)

與正常對照組比較，模型組大鼠ALT，AST，BUN，CREA水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，苦杏仁苷低劑量組大鼠ALT和CREA水平均顯著降低，苦杏仁苷高劑量組大鼠AST，BUN和CREA水平均顯著降低（P＜0.05）；阿司匹林組大鼠BUN和CREA水平均顯著降低（P＜0.05）。詳見表5。

表5 各組大鼠肝腎功能指標(biāo)比較（±s，n=10）Tab.5 Comparison of liver and kidney function indexes of rats in each group（±s，n=10）

表5 各組大鼠肝腎功能指標(biāo)比較（±s，n=10）Tab.5 Comparison of liver and kidney function indexes of rats in each group（±s，n=10）

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3 討論

本研究中，瘀熱互結(jié)證是由角叉菜膠的“致瘀”和干酵母的“致熱”作用，于營血、脈絡(luò)處相互搏結(jié)，相結(jié)為患，致使全身多個(gè)臟腑受損，形成新的特征性復(fù)合疾病大鼠模型。中醫(yī)瘀熱互結(jié)證相關(guān)疾病包括心腦血管疾病、血栓性疾病、內(nèi)臟器官功能障礙、血液系統(tǒng)疾病、傳染性疾病等。阿司匹林不僅具有解熱作用，還能通過抑制環(huán)氧合酶抗炎，同時(shí)減少血小板中血栓素A2的生成，治療瘀熱互結(jié)證的“瘀”和“熱”。瘀熱互結(jié)證臨床表現(xiàn)包括：1）體溫升高；2）舌質(zhì)呈紅紫色、舌下脈絡(luò)肉眼可見變粗長，舌體或舌邊有瘀斑出現(xiàn)；3）多個(gè)部位有深紫、暗紅或鮮紅色血液流出；4）皮膚、指甲可見瘀點(diǎn)、瘀斑；5）出現(xiàn)卷縮、煩躁不安及譫語、神昏等精神異常；6）實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)，PLT增多，肝腎功能異常，血液黏度增高，腎臟病理性損傷，血液流變學(xué)指標(biāo)異常等［11-16］。

本研究中，模型組大鼠中醫(yī)表征評分明顯高于正常對照組，且其體溫較正常對照組明顯升高，說明大鼠瘀熱互結(jié)證模型復(fù)制成功。推測苦杏仁苷的解熱作用與其減少炎性因子IL-6和TNF-α，從而相應(yīng)降低下丘腦視前區(qū)附近前列腺素E2的分布，下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞下調(diào)體溫調(diào)定點(diǎn)，減少產(chǎn)熱有關(guān)［17-18］。

淤血的形成與PLT和凝血四項(xiàng)指標(biāo)變化有關(guān)［19］。本研究中，與正常對照組比較，模型組大鼠PLT和Fib水平升高，PT，TT，APTT均縮短；與模型組比較，苦杏仁苷高、低劑量組大鼠PLT和Fib水平均降低，PT，TT，APTT均延長。表明苦杏仁苷有助于瘀熱互結(jié)證模型大鼠PLT，PT，TT，APTT和Fib水平恢復(fù)正常。ZHANG等［20］研究發(fā)現(xiàn)，苦杏仁苷可改善微循環(huán)障礙，降低血液黏度。WANG等［21］及KUNG等［22］研究發(fā)現(xiàn)苦杏仁苷可降低核因子（NF）-κB水平。

瘀熱互結(jié)證病機(jī)為濕熱瘀毒互結(jié)，侵襲于肝膽，以致肝膽疏泄功能失常，而致肝炎、膽石癥等肝膽疾病，最易表現(xiàn)為肝膽濕熱。瘀熱阻滯在腎和膀胱，導(dǎo)致蓄血，腎氣不固，水府熱結(jié)、氣化失司，亦可出現(xiàn)小便不利，甚至少尿，無尿或尿中帶血，如流行性出血熱并急性腎功能衰竭［23］。本研究中，各組大鼠腎臟指數(shù)無明顯變化，模型組大鼠肝腎功能異常，腎臟有病理性損傷，苦杏仁苷高、低劑量組上述指標(biāo)均有改善。推測苦杏仁苷可通過細(xì)胞信號通路改變組織細(xì)胞的膜穩(wěn)定性以及細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄功能等，提高了實(shí)質(zhì)細(xì)胞在瘀熱互結(jié)證下缺血缺氧的耐受能力，同時(shí)通過改善血液循環(huán)功能，促進(jìn)血液的正常流動(dòng)和缺氧缺血的恢復(fù)，從而保護(hù)肝腎細(xì)胞。

綜上所述，苦杏仁苷對模型大鼠瘀熱互結(jié)證具有良好的改善作用，可降低大鼠體溫，改善瘀斑等體征及保護(hù)腎功能。