高效液相色譜法和酶放大免疫法檢測伏立康唑血藥濃度相關(guān)性分析*

李俊明，卓思珺，陳仕鵬，劉成裕，謝瑞杰

（廣西壯族自治區(qū)柳州市人民醫(yī)院藥學(xué)部，廣西 柳州 545006）

伏立康唑（VRC）為三唑類抗真菌藥，抗菌活性強(qiáng)、抗菌譜廣，臨床應(yīng)用廣泛［1-2］。VRC在體內(nèi)呈非線性代謝、個體差異大，劑量與血藥濃度相關(guān)性不穩(wěn)定，應(yīng)針對患者具體情況并結(jié)合血藥濃度結(jié)果制訂個體化用藥方案，最大限度發(fā)揮療效、減少藥品不良反應(yīng)［3-5］。高效液相色譜（HPLC）法為檢測VRC血藥濃度的常用方法［6］，而近年酶放大免疫（EMIT）法也逐步用于血藥濃度檢測［7-8］。為探討這兩種檢測方法對VRC血藥濃度的影響，本研究中收集VRC達(dá)穩(wěn)態(tài)血藥濃度的真菌感染患者血液樣本59份，分別使用兩種方法進(jìn)行測定，分析測定結(jié)果的相關(guān)性，并對我院兩種檢測方法結(jié)果進(jìn)行比較分析，以便臨床正確解讀檢測數(shù)據(jù)，調(diào)整用藥方案。現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡2～90歲；采血時VRC已達(dá)穩(wěn)態(tài)濃度（即負(fù)荷給藥24 h后或常規(guī)給藥6 d后）。

排除標(biāo)準(zhǔn)：標(biāo)本量＜4 mL；標(biāo)本溶血。

樣本收集：收集醫(yī)院2019年至2020年住院和門診患者常規(guī)VRC檢測樣本2 045份，2019年收集1 054份，其中59份采用2種方法平行檢測，其余均采用HPLC法檢測；2020年收集991份，均采用EMIT法檢測。

1.2 血藥濃度檢測方法

1.2.1 HPLC法

色譜條件：色譜柱為Hypersil ODS柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為25 mmol/L KH2PO4緩沖液-甲醇-乙腈（55∶15∶30，V/V/V）；流速為1.0 mL/min；檢測波長為256 nm；柱溫為35℃；進(jìn)樣量為10 μL。

樣本處理及內(nèi)標(biāo)選擇：采用10 % HClO4溶液沉淀蛋白法前處理血清樣本，以硝西泮作內(nèi)標(biāo)。

方法學(xué)考察：按相關(guān)規(guī)定進(jìn)行精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗考察。結(jié)果表明，儀器精密度良好，供試品溶液在室溫下放置12 h內(nèi)基本穩(wěn)定，方法重復(fù)性良好。

1.2.2 EMIT法

按照Viva-E型全自動生化分析儀（西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品有限公司，定量范圍為0.5～16.0 μg/mL）的操作規(guī)范。取血液樣本，5 000 r/min離心5 min，取上清液，采用EMIT VRC測定試劑檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0及MedCalc 19.0.4統(tǒng)計學(xué)軟件分析。組間差異采用雙側(cè)配對t檢驗、配對Wilcoxon檢驗、Passing-Bablok法和Bland-Altman法分析，并對測定結(jié)果進(jìn)行一致性評價。

2 結(jié)果

2.1 VRC血藥濃度檢測結(jié)果相關(guān)性分析

結(jié)果見表1。計算可知，兩種檢測方法測得的VRC血藥濃度結(jié)果具有高度相關(guān)性（r=0.879，P＜0.05）。

表1 HPLC法及EMIT法VRC血藥濃度檢測結(jié)果（μg/mL，n=59）Tab.1 Results of serum drug concentration determined by HPLC and EMIT（μg/mL，n=59）

2.2 檢測模型建立及相關(guān)性分析

59份樣本的配對樣本t檢驗分析顯示，兩種檢測方法結(jié)果間存在顯著差異。以EMIT法血藥濃度（CEMIT）測定結(jié)果（Y，μg/mL）為縱坐標(biāo)，HPLC法血藥濃度（CHPLC）測定結(jié)果（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，建立回歸方程Y=0.054 7+1.743X（n=59），Spearman相關(guān)系數(shù)為0.923（圖1 A）；配對Wilcoxon測試分析結(jié)果顯示，兩種方法結(jié)果間存在顯著差異。分別以兩種檢測方法結(jié)果的差值（CHPLC-CEMIT）和均值（CHPLC&EMIT）為縱坐標(biāo)和橫坐標(biāo)，以95%的置信區(qū)間設(shè)定血藥濃度的上下限，繪制Bland-Altman偏差圖（圖1 B）。結(jié)果顯示，CEMIT為（5.432 2±3.487 98）μg/mL，高 于HPLC法 的（3.283 1±2.052 87）μg/mL，差值的均數(shù)（d）值的94.9%（56/59）在95%置信度內(nèi)。可見，Wilcoxon檢驗和Bland-Altman分析結(jié)果均顯示兩種檢測方法的一致性差。

圖1 同一質(zhì)量濃度下兩種檢測方法血藥濃度結(jié)果分析A.Linear regression chart B.Bland-Altman deviation plotFig.1 Serum drug concentration determined by two methods at the same mass concentration

2.3 不同質(zhì)量濃度范圍的兩種檢測方法相關(guān)性分析

HPLC法 檢 測VRC有 效 谷 濃 度（Cmin）范 圍 為1.0～5.5 μg/mL［3，7-8］。按3個質(zhì)量濃度范圍，將59份樣本分為A組（＜1.0 μg/mL，6份）、B組（1.0～5.5 μg/mL，40份）和C組（＞5.5 μg/mL，13份），并采用Wilcoxon檢 驗，Passing-Bablok回 歸 和Bland-Altman分 析。A組、B組、C組 的 回 歸 方 程 分 別 為Y1=-5.110+7.385X1（n=6），Y2=-0.012 4+1.853X2（n=40），Y3=-38.494+7.584X3（n=13），Spearman相關(guān)系數(shù)分別為0.771，0.878，0.505。結(jié)果表明，A組和B組兩種檢測方法相關(guān)性較好，而C組相關(guān)性較差。Wilcoxon檢驗結(jié)果顯示，兩種檢測方法結(jié)果在3個質(zhì)量濃度范圍內(nèi)均有顯著差異；Bland-Altman分析結(jié)果表明，CEMIT分別比CHPLC高0.27，2.03，3.39 μg/mL，表明3個質(zhì)量濃度范圍的一致性差。詳見圖2。

圖2 不同質(zhì)量濃度下兩種檢測方法血藥濃度結(jié)果分析A1，B1.Mass concentration＜1.0 μg/mL A2，B2.Mass concentration of 1.0-5.5 μg/mL A3，B3.Mass concentration＞5.5 μg/mL A.Passing-Bablok regression analysis chart B.Bland-Altman deviation plotFig.2 Serum drug concentration determined by two methods under different mass concentrations

2.4 我院患者VRC血藥濃度檢測結(jié)果

2 045份樣本主要來源于重癥醫(yī)學(xué)科、血液科、呼吸科（2019年占92.98%，2020年占92.23%），患者年齡和血藥濃度均符合正態(tài)分布。血藥濃度，HPLC法測定結(jié)果C為（2.67±1.88）μg/mL，最大血藥濃度為11.76 μg/mL；EMIT法測定結(jié)果C為（4.18±2.69）μg/mL，有3例超過峰濃度（16.0 μg/mL）。詳見表2。

表2 我院患者VRC血藥濃度測定結(jié)果（n=2 045）Tab.2 Determination results of VRC serum concentration in patients in our hospital（n=2 045）

3 討論

HPLC法被臨床廣泛用于測定各種藥物的血藥濃度［9-10］，具有靈敏度高、專屬性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。但HPLC法測定前需對樣本進(jìn)行前處理，等待時間長且測定過程復(fù)雜，不適用于大樣本量分析測定［11］。EMIT法屬酶免疫分析技術(shù)，其檢測基于樣本中的藥物與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（G6PD）標(biāo)記的藥物競爭抗體結(jié)合位點(diǎn)，與抗體結(jié)合后，酶活性發(fā)生改變，根據(jù)酶活性來確定樣本中待測藥物的濃度［12］。EMIT法所需樣本體積較小，一直是臨床用于確定內(nèi)源性和外源性物質(zhì)的工具，具有自動化程度高，樣本處理簡單、快速的優(yōu)點(diǎn)，適用于急診和大樣本量分析測定。但EMIT法是利用抗原-抗體相互識別并結(jié)合來產(chǎn)生檢測信號，與待測藥物具有相同的抗原表面標(biāo)志（如代謝物、內(nèi)源性物質(zhì)等）或抗體有多個抗原結(jié)合位點(diǎn)時，會干擾檢測結(jié)果；同時，樣本質(zhì)量、環(huán)境溫度等因素也顯著影響檢測結(jié)果。因而其靈敏度和準(zhǔn)確性相對較低。EMIT法測定人血漿中VRC濃度時，可能無法區(qū)分藥物與VRC類似物或代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致產(chǎn)生的值更高影響結(jié)果［13-14］。

目前，關(guān)于VRC目標(biāo)血藥濃度和用藥方案調(diào)整推薦的研究中多數(shù)是基于HPLC法的檢測結(jié)果。丁記者等［14］及闞智慧［15］對樣本進(jìn)行對比研究，均發(fā)現(xiàn)兩種檢測方法具有明顯的相關(guān)性和一致性，LI等［13］對比了419例兒童樣本的測定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)兩種檢測方法存在明顯相關(guān)性，但EMIT法測定結(jié)果顯著高于HPLC法。本研究結(jié)果顯示，兩種檢測方法存在較好的相關(guān)性，但總體上EMIT法與HPLC法測定結(jié)果有顯著差異。在0～5.5 μg/mL范圍內(nèi)兩種檢測方法具有很好的相關(guān)性。Wilcoxon測試和Bland-Altman分析表明在3個質(zhì)量濃度范圍，EMIT法結(jié)果均較HPLC法高，并存在顯著差異。

因本研究中平行對比的樣本量偏小，故對我院HPLC法（1 054例）和EMIT法（991例）的測定結(jié)果進(jìn)行回顧性分析以作為補(bǔ)充。結(jié)果表明，在樣本主要來源科室分布相近、年齡和血藥濃度均符合正態(tài)分布的情況下，EMIT法較HPLC法測定結(jié)果普遍偏高。

上述研究之所以出現(xiàn)不同的結(jié)論，可能與樣本來源有一定關(guān)系，已建立的HPLC法線性范圍較窄，樣本測定結(jié)果較集中，均與治療窗濃度1.0～5.5 μg/mL接近［15］。丁記者等［14］的研究對象為口服VRC患者，可能病情和所使用藥物種類相對簡單，而LI等［13］的研究樣本主要為兒童，其中大多數(shù)接受了造血干細(xì)胞移植，同時使用了多種藥物造成干擾。本研究中患者主要來源于重癥監(jiān)護(hù)室，病情和用藥情況復(fù)雜，測定結(jié)果分布范圍寬。另外，造成結(jié)論不一與樣本量也有一定關(guān)系，本研究樣本量偏小，回顧性數(shù)據(jù)欠嚴(yán)謹(jǐn)。因此，關(guān)于兩種檢測方法的相關(guān)性和一致性需更大樣本量、更進(jìn)一步的深入研究。

綜上所述，EMIT法和HPLC法檢測VRC血藥濃度時，結(jié)果總體相關(guān)性良好，鑒于EMIT法存在測定結(jié)果偏高的可能，建議在臨床檢測時，尤其是對于病情復(fù)雜、用藥品種多的患者，應(yīng)予以關(guān)注并作相應(yīng)調(diào)整，同一患者多次檢測應(yīng)使用同一種方法，以便為臨床提供更準(zhǔn)確可靠的個體化用藥依據(jù)。