復方硝酸甘油凝膠劑對慢性難愈性創面的作用*

程靜，盧立，關鑫磊，吳濤，劉立，任朝陽，宋紅萍

(1.武漢市第四醫院藥學部，武漢 430033； 2.武漢市東西湖區醫保局，武漢 430041)

慢性難愈性創面，如糖尿病足、壓瘡、放射性潰瘍、靜脈淤滯性潰瘍等是臨床常見的疾病，病程長，病情遷延難愈，嚴重影響患者的生活質量，成為臨床上急需解決的難點。武漢市第四醫院制劑室研發的復方硝酸甘油凝膠劑，前期實驗顯示其具有調節潰瘍創面新生毛細血管數量、促進創面愈合的作用[1]。本實驗探索復方硝酸甘油凝膠劑對激素誘導的慢性難愈性創面的作用。現階段慢性難愈性創面尤其是高糖環境所致的慢性難愈性創面的患者不斷增多，本實驗考察復方硝酸甘油凝膠劑對高糖誘導人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs) 損傷的作用，為后續研究其對糖尿病性慢性難愈性創面的作用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞 HUVECs細胞株由武漢普諾賽生命科技有限公司提供。取含10%胎牛血清(FBS)、1%雙抗的F12K培養基置于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)細胞培養箱中傳代培養。每隔1 d換液，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.1.2實驗動物 無特定病原體(SPF)級，SD雄性大鼠30只，體質量220～250 g，購自華中科技大學同濟醫學院實驗動物中心，動物生產許可證號：SCXK(鄂)2021-0009。動物自由進食飲水，12 h明暗交替光照，環境溫度23～27 ℃，相對濕度45%～75%。所有實驗操作遵循國際衛生研究機構關于動物使用倫理學方面的原則。

1.1.3主要試劑和儀器 復方硝酸甘油凝膠劑(制劑室在研，處方由硝酸甘油5%，醋酸氯己定0.3%等組成，批號：20200429)。京萬紅(批號：211509)，購于天津達仁堂達二藥業有限公司；0.1 g注射用氫化可的松琥珀酸鈉(批號：202107041)，購于煙臺東誠北方制藥有限公司；白細胞介素(IL)-1、IL-10試劑盒(批號：20211104，20211027)，購于南京建成生物工程研究所；DMEM/F12培養液(貨號：SH30023)，購于武漢普諾賽生命科技有限公司；Transwell小室，購于美國Corning公司；胎牛血清(貨號：141215)，購于杭州天杭生物科技有限公司；胰酶-EDTA(貨號：GNM25200)、磷酸鹽緩沖液(PBS，貨號：GNM20012)，購于吉諾生物醫藥技術有限公司；CCK-8檢測試劑盒(貨號：C0038)，購于碧云天生物技術有限公司；結晶紫染液(貨號：AS1086)，購于武漢阿斯本生物技術有限公司；CO2恒溫培養箱(SCO6WE)由SHEL LAB提供；潔凈工作臺(SW-CJ-1FD)由蘇凈安泰提供；酶標檢測儀(DR-200Bs)由Diatek提供。病理組織包埋冷凍臺(BMJ-A型)由中國常州市中威電子儀器有限公司提供；自動組織脫水機，VP1～JC，由日本櫻花公司提供；石蠟切片機(LEICA RM2235)由德國提供；倒置顯微鏡(IX51)由日本OLYMPUS公司提供。Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件，美國Media Cybernetics公司提供。

1.2方法

1.2.1對高糖誘導HUVECs細胞損傷模型細胞活力的影響 前期已通過CCK-8法檢測復方硝酸甘油對HUVECs細胞存活率的試驗，選取細胞存活率在80%以上且對細胞活力無顯著性影響的濃度作為后續實驗的給藥濃度[2]。將對數生長期細胞用胰蛋白酶消化，配制成濃度為每毫升懸液1×105個細胞，按每孔1×104個細胞接種于96孔板，每孔加100 μL，置于CO2(5%)培養箱中37 ℃下培養24 h。細胞分組，分為正常對照組(葡萄糖濃度為5.5 mmol·L-1)，模型對照組(葡萄糖濃度為33 mmol·L-1)，實驗組(分別加入終濃度為0.01，0.1，1 mmol·L-1的復方硝酸甘油凝膠劑，葡萄糖濃度為33 mmol·L-1)，每組6個復孔。給藥后72 h，每孔加入CCK-8溶液10 μL，培養箱中孵育2 h，使用酶標儀測定波長450 nm處吸光度(A值)。以溶劑處理的細胞為對照組，按公式計算復方硝酸甘油凝膠劑對細胞的相對存活率，細胞存活率(%)=(實驗組A值/模型對照組A值)×100%。

1.2.2對高糖誘導HUVECs細胞損傷模型Transwell遷移能力的影響[3]取對數期生長的HUVECs細胞，將細胞制成每毫升懸液1×105個細胞，取細胞懸液1 mL于1500 r·min-1離心5 min，棄上清液。加入無血清培養基1 mL，吹打均勻后取細胞懸液200 μL放入transwell小室中，上室各接種上正常對照組的HUVECs細胞及經高糖誘導細胞損傷的HUVECs細胞，下室加入含不同濃度復方硝酸甘油凝膠劑的條件培養基(同“1.2.1”)。24孔板中加入含10% FBS的完全培養基500 μL，將小室放入板中，在37 ℃細胞培養箱培養72 h。將小室取出，用PBS洗去培養基，用棉簽將上室中的膠和細胞擦除干凈，多聚甲醛固定20 min，PBS洗2次，結晶紫染色10 min，洗去表面的結晶紫，于倒置顯微鏡下對非細胞接種側攝相同時對附著在小室膜下室側經結晶紫染色后攝相(顯微鏡放大倍數×100)，Image J軟件分析各組細胞的遷移細胞計數，隨機計數6個視野，取平均值，每組重復3次。

1.2.3對高糖誘導HUVECs細胞損傷模型劃痕實驗的影響[4]先用Marker筆在6孔板背后均勻畫平行的直線，0.5～1 cm一道，橫穿過孔，每孔5條。取對數期生長的HUVECs細胞，調整細胞懸液濃度使鋪板細胞密度為5×105個·mL-1，將細胞接種到6孔板中，每孔加入細胞懸液2 mL，培養孵育72 h。待細胞單層在6孔板底部鋪滿時，用200 μL無菌槍頭垂直于Marker筆的橫線劃痕，PBS清洗3次，按照上面分組加入不同藥物和培養基(同“1.2.2”)，置于5%CO2培養箱中37 ℃下培養24 h。倒置光學顯微鏡下觀察并攝相，使用IPP軟件測量0 h以及24 h的細胞劃痕面積(間隙寬度)的平均長度來確定遷移程度，計算公式：劃痕愈合百分比(%)=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.4對激素誘導的慢性難愈性創面修復作用實驗研究[5-6]雄性SD大鼠適應性飼養1周后用于潰瘍模型的建立，用10%水合氯醛0.4 g·kg-1腹腔內麻醉后背部剃毛，用直徑為2 cm的打孔器在背部正中打孔，深度達到筋膜層，2 h后創面局部多處肌內注射0.8%氫化可的松(給藥劑量80 mg·kg-1)，制成難愈性創面模型。然后按體質量采用隨機數字表法隨機分為3組，每組10只，動物皮膚給藥按照每平方厘米計算，分別為復方硝酸甘油凝膠劑組(0.98 g·kg-1)、陽性組(京萬紅)(0.79 g·kg-1)、模型對照組(等量空白凝膠基質)。各組于造模次日開始涂藥。各組分別在造模后第14天取創面中心肉芽組織馬松(Masson)染色，用Image-Pro plus(IPP)6圖像分析軟件測定創面膠原蛋白面積與視野內創面的總面積，兩者比值的百分比即為膠原蛋白含量，記錄并計算平均值。采用ELISA法測定血清IL-1、IL-6水平。

2 結果

2.1對高糖誘導HUVECs細胞損傷模型細胞活力的影響 預實驗確定使用含33 mmol·L-1葡萄糖的高糖培養基誘導細胞損傷72 h作為細胞損傷模型。本實驗結果顯示，與正常對照組比較，高糖環境對HUVECs細胞增殖能力明顯減弱，細胞相對存活率降低，差異具有統計學意義(P<0.01)；與模型對照組比較，隨著藥物濃度的增加，0.1，1 mmol·L-1復方硝酸甘油凝膠劑對HUVECs細胞增殖能力明顯增加，細胞相對存活率提高，呈現濃度依賴性(均P<0.01)，說明復方硝酸甘油凝膠劑能在一定程度上提高高糖誘導的HUVECs細胞損傷模型的細胞活力，對高糖誘導的HUVECs細胞損傷模型具有保護作用。見圖1。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.小劑量組；D.中劑量組；E.大劑量組。①與正常對照組比較，t=15.699，P<0.01；②與模型對照組比較，t=6.343，11.255，P<0.01。圖1 高糖誘導HUVECs細胞損傷模型細胞活力 A.normal control group；B.model control group；C.low dose group；D.middle dose group；E.high dose group.①Compared with normal control group，t=15.699， P<0.01；② Compared with model control group，t=6.343，11.255， P<0.01.Fig.1 Effect of compound nitroglycerin gels on cell viability of high glucose-induced HUVECs injury model

2.2對高糖誘導HUVECs細胞損傷模型Transwell遷移能力的影響 正常對照組、模型對照組、小劑量組、中劑量組、大劑量組每視野穿過Transwell小室的細胞數分別為132.80±5.22，40.20±5.93，49.60±5.03，69.40±5.41，102.00±5.70。與正常對照組相比，模型對照組遷移細胞數明顯減少(P<0.05)；與模型對照組相比，復方硝酸甘油凝膠劑處理后各組均能夠增加高糖誘導的HUVECs細胞損傷模型向Transwell下室遷移的能力，其中0.01，0.1，1 mmol·L-1復方硝酸甘油凝膠劑遷移數目明顯增加，呈現濃度依賴性，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.01)。見圖2。

A.正常對照組；B. 模型對照組；C.小劑量組；D.中劑量組；E.大劑量組。①與正常對照組比較，t=28.714，P<0.01；②與模型對照組比較，t=2.960，P<0.05；③與模型對照組比較，t=8.906，18.398，P<0.01。圖2 高糖誘導HUVECs細胞損傷模型Transwell遷移能力(×100) A.normal control group；B.model control group；C.low dose group；D.middle dose group；E.high dose group.①Compared with normal control group，t=28.714，P<0.01；②Compared with model control group，t=2.960，P<0.05；③Compared with model control group，t=8.906，18.398， P<0.01.Fig.2 Effect of Compound nitroglycerin gels on migration of glucose-induced HUVECs injury model(×100)

2.3對高糖誘導HUVECs細胞損傷模型劃痕實驗的影響 正常對照組、模型對照組、小劑量組、中劑量組、大劑量組24 h劃痕愈合比分別為(75.91±0.89)%，(20.23±2.60)%，(25.86±2.53)%，(45.83±1.62)%，(58.33±1.44)%。與正常對照組比較，模型對照組細胞遷移能力明顯減弱，劃痕愈合百分比明顯減少，差異有統計學意義(P<0.01)。與模型對照組相比，復方硝酸甘油凝膠劑處理后各組無細胞寬度明顯縮小，其中0.01，0.1，1 mmol·L-1復方硝酸甘油凝膠劑能明顯促進劃痕愈合，呈現濃度依賴性，差異有統計學意義(P<0.05)，提示復方硝酸甘油凝膠劑能夠促進高糖誘導的HUVECs細胞損傷模型的劃痕愈合。見圖3。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.小劑量組；D.中劑量組；E.大劑量組。①與正常對照組比較，t= 49.630，P<0.01；②與模型對照組比較，t=3.801，20.470，31.400，P<0.01。圖3 高糖誘導HUVECs細胞損傷模型劃痕愈合能力(×40) A.normal control group；B.model control group；C.low dose group；D.middle dose group；E.high dose group.①Compared with normal control group，t=49.630，P<0.01；②Compared with model control group，t=3.801，20.470，31.400，P<0.01.Fig.3 Effect of Compound nitroglycerin gels on the ability of scratch wound-healing(×40)

2.4對激素誘導的慢性難愈性創面修復作用實驗研究 與模型對照組比較，給藥后第14天復方硝酸甘油凝膠劑組膠原蛋白含量比明顯增加，IL-1、IL-6含量降低(P<0.05)。與京萬紅組比較，復方硝酸甘油凝膠劑組膠原蛋白含量比有增加趨勢，IL-1、IL-6含量有降低趨勢(P>0.05)，見表1。本研究中采用Masson染色觀察創面愈合早期膠原沉積，染色后膠原纖維呈藍色。模型對照組膠原纖維束稀疏，排列紊亂；京萬紅組膠原纖維較粗，排列較規則；復方硝酸甘油凝膠劑組成纖維排列較整齊致密，較粗大，排列有序。見圖4。

表1 復方硝酸甘油凝膠劑對膠原蛋白含量比的影響 Tab.1 Effects of compound nitroglycerin gels on the content of collagen in skin ulcer rats

A.模型對照組；B.京萬紅組；C.復方硝酸甘油凝膠劑組。圖4 復方硝酸甘油凝膠劑對創面膠原纖維生成的影響(Masson，×40) A.model control group；B.Jinwanhong group；C.Compound nitroglycerin gels group.Fig.4 Effect of compound nitroglycerin gels on the formation of collagen fiber in the wound(Masson，×40)

3 討論

血管新生受損、局部供血不足是導致慢性難愈性創面的主要原因之一[3]。新生血管內皮細胞的增殖和遷移是促進創面愈合的關鍵步驟。創面早期成纖維細胞可直接與炎癥細胞相互作用，參與控制創面炎癥反應[7]。早期病原體入侵促使吞噬細胞與自然殺傷細胞活化，產生細胞因子，使更多的抗體、補體和免疫細胞集中于炎癥部位，誘導獲得性免疫，是機體抵御外來感染和創傷等的保護反應[8]。其中IL-1、IL-6與創面的急性炎癥反應密切相關，對機體組織的影響更為重要[9]。炎癥期，創面組織中的巨噬細胞促進成纖維細胞的增殖和分化，成纖維細胞能夠分泌多種生長因子，如一氧化氮(NO)，增強膠原合成并促進愈合[10]。

硝酸甘油屬于硝酸酯類藥物，臨床上主要用于心絞痛、急性心肌梗死、充血性心力衰竭等。硝酸甘油進入機體后轉化為NO發揮作用。SCHAFFER等[11]發現NO能促進創面血管生成及內皮細胞、角質細胞等遷移和增殖，參與創面愈合的過程。高糖環境所致的慢性難愈性創面的不斷增多，本研究探討復方硝酸甘油凝膠劑對慢性難愈性創面的作用。細胞活力結果顯示，與對照組比較，高糖環境能明顯抑制HUVECs細胞增殖，使細胞相對存活率降低，說明高糖誘導HUVECs細胞損傷。復方硝酸甘油凝膠劑能促進高糖環境下HUVECs細胞的增殖，提高細胞活力，對高糖誘導的HUVECs細胞損傷模型具有保護作用；遷移實驗結果顯示，與對照組相比，高糖環境下HUVECs細胞向Transwell下室遷移細胞數明顯減少，遷移能力明顯減弱，劃痕愈合百分比明顯減少，但經復方硝酸甘油凝膠劑干預后HUVECs細胞向Transwell下室遷移數增加，劃痕愈合百分比明顯增加，且隨著濃度的增加，其促遷移能力、愈合能力也增加，從而有利于血管新生，促進創面愈合。本研究中體內實驗顯示復方硝酸甘油凝膠劑能明顯降低激素誘導的慢性難愈性大鼠14天后創面IL-1、IL-6的含量，降低創面早期的炎癥反應，本研究與劉麗平等[12]研究相互印證，這可能與硝酸甘油在體內轉化成NO使血管平滑肌松弛，減少白細胞和血小板黏附，減輕組織水腫，改善微循環，從而減少炎癥因子釋放有關。復方硝酸甘油凝膠劑能增加給藥14天后膠原蛋白含量比，促進成纖維細胞增殖和膠原纖維沉積，增加肉芽組織形成，促進潰瘍創面的愈合。

綜上所述，在以高糖誘導的HUVEs細胞損傷模型及激素誘導的慢性難愈性創面大鼠模型為載體基礎上，發現復方硝酸甘油凝膠劑作為NO供體的硝酸甘油在一定范圍內增加內皮細胞增殖的作用，促進內皮細胞的遷移，具有較好的促血管生成和促創面愈合活性；調控創面的炎癥細胞和成纖維細胞相互作用，降低創面的炎癥反應，炎癥細胞能夠促進成纖維細胞的增殖和分化，促進膠原蛋白的合成，進而促進創面愈合。