大黃素誘導LXRα-ABCA1信號通路減少非酒精性脂肪性肝病細胞模型的脂質沉積*

寧巍，楊金連，張濤

[1.湖南省人民醫院(湖南師范大學附屬第一醫院)藥學部，長沙 410005；2.廣州市婦女兒童醫療中心藥學部，廣州 510623]

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是目前嚴重的公共健康問題之一。隨著人們生活水平提高，NAFLD患病率日益升高，已是繼病毒性肝炎后我國第二大常見肝病[1]。目前，NAFLD的治療藥物主要包括抗氧化藥物和他汀類藥物等，但他汀類藥物在治療NAFLD同時會出現肌肉毒性和肝毒性等不良反應[2]，限制了其臨床應用。中藥有效成分在NAFLD的防治中起著重要的作用，藥理研究發現中藥大黃的有效成分大黃素有抗炎、抗腫瘤、鎮痛和抗氧化等功效[3-4]。劉鳴昊等[5]報道大黃素在動物模型中可能有緩解NAFLD的作用，但具體機制仍有待進一步研究。

ATP結合盒轉運體A1(ATP-binding cassette transporter A1，ABCA1)是ATP能源轉運蛋白，可調控膽固醇逆向轉運，對維持細胞脂質平衡起著重要作用[6]。研究發現，ABCA1受到肝X受體α(liver X receptor α，LXRα)的調控，激活LXRα可增加ABCA1表達，并增加細胞轉運出膽固醇的能力[7]。激活LXRα-ABCA1通路成為降脂藥物研究的熱點。本研究利用油酸和棕櫚酸誘導HepG2建立NAFLD體外細胞模型，考察大黃素對細胞脂質堆積和LXRα-ABCA1通路的影響，探究其治療NAFLD的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1儀器與設備 Nano Drop 2000超微量分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific公司)，ETC-811逆轉錄儀(東勝創新生物科技有限公司)，實時熒光定量PCR儀 480(瑞士Roche公司)，FluorChem R型多功能成像分析系統(美國protein Simple公司)，M1000PRO型多功能酶標儀(奧地利TECAN公司)，Axio Observer A1型倒置熒光顯微鏡(德國卡爾蔡司公司)。

1.1.2藥品與試劑 大黃素(阿拉丁試劑公司，含量>96%)，實驗用高脂細胞添加劑(西安鯤創科技公司)，CCK-8試劑(TARGETMOI公司)，三酰甘油(TG)測試盒(南京建成生物科技公司)，膽固醇(TC)測試盒(南京建成生物科技公司)，油紅O工作液(西格瑪奧德里奇公司)，LXRα抗體(美國Abcam)，ABCA1抗體(美國Novus Bidogicals)，GAPDH抗體(杭州弗德生物科技公司)，尼羅紅(北京博奧拓達科技公司)，M02對照質粒及LXRα過表達質粒(廣州復能基因公司)，ABCA1雙熒光素酶質粒(廣州艾西龍生物科技公司)，雙熒光素酶報告基因檢測系統(上海普洛麥格生物產品公司)。PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列和產物長度信息見表1。

表1 PCR引物序列 Tab.1 PCR primer sequence

1.2方法

1.2.1細胞培養 HepG2細胞復蘇后，用含10%胎牛血清和1%青鏈霉素的DMEM培養基(完全培養基)于37 ℃、5%二氧化碳(CO2)的恒溫培養箱中培養。于顯微鏡下觀察細胞的生長狀態，待細胞融合度達80%～90%時，以胰酶消化傳代后進行后續實驗。

1.2.2細胞給藥 取對數生長期的細胞，按每孔1×104個接種于兩個96孔板中，分為正常對照組、模型對照組和不同濃度大黃素組。模型對照組加入500 μmol·L-1油酸溶液和250 μmol·L-1棕櫚酸溶液，每組設復孔5個。培養48 h后，其中一個96孔板用于細胞活性檢測，每孔加入CCK-8試劑10 μL，將培養板放在培養箱培養30 min，用酶標儀測定在波長450 nm處吸光度(A值)。計算細胞存活率公式：細胞存活率(%)=(實驗組A值-調零孔A值)/(對照組A值-調零孔A值)×100%。

1.2.3尼羅紅染色測定吸光度 用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)將96孔板的細胞洗3次，每次5 min。每孔加入稀釋后的1：2000尼羅紅工作液100 μL ，孵育15 min，用PBS洗3次。將酶標儀的激發光波長設置為485 nm，發射波長設置580 nm后，測定熒光強度。

1.2.4TG和TC含量的測定 取對數生長期的細胞接種于6孔板中，然后分為正常對照組、模型對照組、大黃素治療組(10 μmol·L-1)和阿托伐他汀鈣組(1 μmol·L-1)[8]，每組設復孔4個。細胞培養48 h后，收集細胞并加入乙醇，采用超聲波細胞破碎儀破碎細胞，收集細胞勻漿液。按照TG和TC檢測試劑盒說明書相關方法檢測細胞中TG和TC含量。

1.2.5油紅O染色觀察細胞中脂質蓄積 取對數生長期細胞接種于6孔板中，按照“1.2.2”項下方法分組、造模與給藥，每組設復孔3個。細胞培養48 h后用PBS洗3次，加入4%多聚甲醛固定液固定30 min；用70%異丙醇孵育5 min；棄去異丙醇，加入油紅工作液孵育20 min；棄去染色液水洗后加入蘇木精染色液復染1～2 min。于顯微鏡下觀察細胞中脂質蓄積情況。

1.2.6實時熒光定量PCR測定mRNA表達水平 取對數生長期細胞接種于6孔板中，按“1.2.2”項下方法分組、造模與給藥，每組設復孔4個。細胞培養48 h后，按照RNA提取試劑盒說明書提取細胞mRNA。PCR擴增反應體系如下：cDNA模板2 μL，2X Power Green qPCR Mix 10 μL，上、下游引物0.4 μL，無酶水7.2 μL。反應條件為：94 ℃，3 min；94 ℃，5 s；60 ℃，5 s；72 ℃，10 s；共40個循環。采用2ΔΔCt法計算mRNA表達水平。

1.2.7Western blotting檢測LXRα、ABCA1的蛋白表達水平 取對數生長期細胞接種于6孔板中，按照“1.2.2”項下方法分組、造模與給藥，每組設復孔3個。細胞培養48 h后，棄去培養基，用PBS洗3次，加入RIPA 裂解液提取總蛋白，BCA蛋白濃度測定，蛋白經煮沸變性后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉膜；加入ECL化學發光試劑，采用多功能成像分析系統進行成像。采用Image J軟件分析，以目的蛋白灰度值與內參GAPDH灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。

1.2.8雙熒光素酶報告基因實驗 取對數生長期細胞接種于24孔板，待細胞融合度達約70%進行轉染。采用Lipofectamine 3000進行轉染，將600 ng pEZ-M02 對照質粒或LXRα過表達質粒、300 ng ABCA1啟動子質粒和30 ng pRL-TK共轉染于細胞中。24 h后加入10 μmol·L-1大黃素。24 h后棄去培養基，加入裂解液，在室溫下輕柔震蕩20 min。采用Promega 報告基因檢測試劑盒和多功能酶標儀檢測熒光素酶的活性，并計算熒光素酶與海腎熒光素酶活性的相對比值。

1.2.9RNA干擾實驗 取密度為60%～80%的HepG2細胞，加入10 nmol·L-1LXRα-siRNA 或Control-siRNA溶液， 放入CO2培養箱繼續培養24 h后，或加入10 μmol·L-1大黃素繼續培養24 h后，再收集細胞。

1.2.10統計學方法 使用SPSS 20.0版軟件和GraphPad Prism 8.0版軟件進行統計分析和繪圖。

2 結果

2.1大黃素對高脂誘導后HepG2細胞存活率的影響 結果見圖1。與正常對照組比較，模型對照組細胞存活率下降，相對尼羅紅熒光強度升高。與模型對照組相比，10 μmol·L-1大黃素組相對尼羅紅熒光強度顯著下降，并且細胞存活率恢復至最高(0.978 7±0.138 6)。因此，本研究選取降脂效果良好并對細胞活性無明顯影響的10 μmol·L-1大黃素進行后續實驗。

①與正常對照組比較，t=13.68，5.17，P<0.05；②與模型對照組比較，t=2.553～5.83，P<0.05。圖1 大黃素劑量依賴性降脂藥效和細胞毒性評價①Compared with normal control group，t=13.68，5.17，P<0.05；②Compared with model control group，t=2.553-5.83，P<0.05.Fig.1 Evaluation of emodin dose-dependent reduction of lipid efficacy and

2.2大黃素對高脂誘導后HepG2細胞中脂質蓄積的影響 油紅O染色和顯示與正常對照組相比，NAFLD模型組脂質堆積明顯增加，細胞中TG和TC含量顯著升高。與模型對照組相比，大黃素組與阿托伐他汀鈣組的油紅染色中脂滴的大小和數量都明顯減少，細胞中TC含量顯著降低(圖2-4)。

圖2 大黃素對HepG2細胞中脂質蓄積影響的顯微圖(油紅O染色，×400) Fig.2 Effect of Emodin on lipid accumulation in HepG2 cells (oil red O staining，×400)

圖3 大黃素對HepG2細胞中脂質蓄積影響的顯微圖(尼羅紅熒光染色，×400) Fig.3 Micrograph of the effect of Emodin on lipid accumulation in HepG2 cells (Nile red fluorescence staining，×400)

①F=4.86，P<0.05；方差不齊，與正常對照組比較，P<0.05。②F=17.29，P<0.01；方差齊與正常對照組比較，P<0.05；③與模型對照組比較，P<0.05。圖4 各組細胞中TG和TC含量的測定結果①F=4.86，P<0.05；The variance was uneven，compared with normal control group，P<0.05。②F=17.29，P<0.01；The variance was uniform，companed with normal control group，P<0.05；③Compared with model control group，P<0.05.Fig 4 TG and TC content of cells in each group n=4)

2.3大黃素對高脂誘導后HepG2細胞中脂質合成和代謝通路中相關基因mRNA表達的影響 如圖5所示，對與脂質合成代謝有關的核轉錄因子進行mRNA檢測，發現大黃素組對NR1H2、FXR、CAR等核轉錄因子無影響，但顯著提高LXRα的轉錄水平。與模型對照組比較，大黃素組中ABCA1的轉錄水平顯著上升。

①F=9.86，P<0.05；方差齊，與正常對照組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05；③F=40.36，P<0.05；方差齊，與模型對照組比較，P<0.05。圖5 各組細胞與脂質合成和代謝通路相關基因mRNA表達水平的測定結果①F=9.86，P<0.05；The variance was uniform，compared with normal control group，P<0.05；②Compared with model control group，P<0.05。③F=40.36，P<0.05；The variance was uniform，compared with model control group，P<0.05.Fig 5 mRNA expression of genes related to lipogenesis and lipolysis pathway in each group of

2.4大黃素對高脂誘導后HepG2細胞中LXRα-ABCA1通路相關蛋白表達的影響 根據“2.3”項下mRNA的檢測結果，進一步檢測各組LXRα、ABCA1的蛋白表達水平。如圖6所示，與高脂模型對照組相比，大黃素組細胞中LXRα和ABCA1的蛋白表達水平顯著升高。

①F=174.07，P<0.05；方差齊，與正常對照組比較，P<0.05；②與模型對照組比較，P<0.05；③F=38.87，P<0.05；方差不齊，與模型對照組比較，P<0.05。圖6 大黃素對HepG2細胞中LXRα-ABCA1通路相關蛋白表達影響的免疫印跡圖①F=174.07，P<0.05；The variance was uniform，compared with normal control group，P<0.05；②Compared with model control group，P<0.05；③F=38.87，P<0.05；The variance was uniform，compared with model control group，P<0.05。Fig 6 Western blotting images of the effect of emodin on the protein expression of LXRα-ABCA1 pathway in HepG2

2.5大黃素提高HepG2細胞中LXRα-ABCA1雙熒光素酶系統的相對熒光值 結果見圖7，與M02對照載體組相比，加入LXRα后能夠顯著提高ABCA1雙熒光素酶系統的相對熒光值，證明LXRα-ABCA1雙熒光素酶系統構建成功。而加入大黃素后，能夠進一步提高LXRα-ABCA1雙熒光素酶系統的相對熒光值。

①F=19.09，P<0.05；方差不齊，與M02對照載體組比較，P<0.05；②與LXRα對照組比較，P<0.05。圖7 大黃素對HepG2細胞中LXRα-ABCA1轉錄活性的影響①F=19.09，P<0.05；he variance was uniform，compared with M02 group，P<0.05；②Compared with LXRα group，P<0.05。Fig 7 Effect of emodin on transcription activity of LXRα-ABCA1 in HepG2 cells

2.6敲低LXRα基因后，大黃素對HepG2細胞中脂質蓄積的影響 結果見圖8，與正常對照組相比，敲低LXRα的細胞經大黃素處理后，細胞內脂滴的大小和數量均明顯增多，結果表明敲低LXRα后大黃素降脂能力顯著降低。

圖8 敲低LXRα后，大黃素對HepG2細胞中脂質蓄積影響的顯微圖(油紅O染色，×400) Fig.8 Effect of Emodin on lipid accumulation in siLXRα HepG2 cells (oil red O staining，×400)

3 討論

成人NAFLD全球流行率約為25%[9]。隨著生活方式的快速轉變，我國NAFLD的發展日益加快，已成為一個重大的公共衛生問題[10]。因此，積極尋找NAFLD的治療藥物是臨床亟待解決的問題。

本研究以高脂細胞添加劑誘導HepG2細胞產生脂質堆積，構建體外NAFLD細胞模型，以探討大黃素對NAFLD脂質代謝紊亂的改善作用及相關機制。結果顯示，HepG2細胞經高脂細胞添加劑誘導48 h后，細胞中脂滴數目增加，TG和TC含量均顯著升高，表明脂質堆積模型構建成功。經大黃素干預后，細胞中脂滴數目明顯減少，TC含量顯著降低，表明大黃素可以減少NAFLD細胞中的脂質堆積。

ABCA1利用ATP作為能量運輸膽固醇和磷脂等分子，在膽固醇運輸中發揮重要作用。膽固醇代謝異常參與NAFLD和肝纖維化的發病機制。研究報道，在患者中，肝臟ABCA1蛋白水平顯著降低[10]，在小鼠NAFLD模型中，脂肪變性與ABCA1蛋白表達降低和肝臟脂質儲存增加有關，而ABCA1過度表達導致膽固醇流出增加和肝臟脂質含量降低[11]。國內研究報道消瘀化痰中藥，紫檀茋和四逆散等促使ABCA1的表達上調，減輕脂質沉積，改善肝組織的病變程度[12-14]。本研究結果顯示，大黃素顯著升高HepG2細胞中的LXRa和ABCA1的mRNA和蛋白的表達，并提高LXRα-ABCA1雙熒光素酶系統的相對熒光值，證明大黃素可以激活LXRα-ABCA1信號通路。敲低LXRα后，大黃素改善HepG2細胞的脂質堆積的作用降低。綜上所述，大黃素可通過調節LXRα-ABCA1通路促進細胞內脂質外排，達到降脂效果。