瑞戈非尼對肝癌細胞凋亡及琥珀酸脫氫酶D表達的影響*

吳亞菲，刁文婧，周鶴鳴，李琴

(上海交通大學附屬第一人民醫院臨床藥學科，上海 200080)

肝細胞癌 (hepatocellular carcinoma，HCC)是肝癌主要的組織學亞型，以高復發、難治愈的特征成為全球第二大致死腫瘤[1]。肝癌治療指導原則建議[2-3]：早期肝癌患者優選外科切除、肝移植及射頻消融等治療方式；對于疾病進展期但肝功能尚可且無血道轉移的患者優先選擇化療栓塞；對于無法進行局部治療的患者，推薦采取以口服索拉非尼為代表的全身治療方式[4]。早期肝癌癥狀通常不明顯，當癥狀出現時，大多數患者已發展至晚期。然而，晚期患者索拉非尼藥物治療效果不佳，索拉非尼耐藥后使用瑞戈非尼能在一定程度上延長患者生存期，但其療效依舊有限[5]。因此，尋找肝癌藥物治療的新靶點至關重要。琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase，SDH)是含4個亞單位(A、B、C、D)的蛋白復合物，主要定位在線粒體內膜上[6]。研究表明，SDH各個亞單位參與三羧酸循環及線粒體呼吸鏈。其中SDHA催化琥珀酸生成富馬酸；SDHB作為重要組分參與電子傳遞鏈中泛醌到泛醇的氧化過程；SDHC及SDHD主要協助SDH蛋白錨定在線粒體上，保證電子傳遞鏈工作井然有序。研究發現SDH各亞單位表達異常引起細胞代謝紊亂及腫瘤發生[7-9]；SDHD/PTEN/自噬軸參與調控甲狀腺癌的發生與發展[10]；TGF-β/SDHD/HIF-1α軸影響骨肉瘤化療耐藥[11]。SDHD可能是調控腫瘤發生與發展的重要靶點。然而，SDHD在肝癌發展中的作用尚不明確。本研究旨在探究瑞戈非尼對肝癌細胞凋亡及對SDHD表達水平的影響，觀察SDHD對肝癌細胞增殖、瑞戈非尼藥物作用及肝癌預后的影響。

1 材料與方法

1.1藥物與試劑 瑞戈非尼(MedChemExpress公司，批號：HY-10331，純度≥99.0%)；二甲亞砜(Sigma-Aldrich公司，批號：RNBF8134)；AKT信號通路激動劑SC79(MedChemExpress公司，批號：HY-10358，含量≥98.0%)；AKT信號通路抑制劑MK2206(MedChemExpress公司，批號：HY-18749，含量≥99.0%)；胎牛血清(Gibco公司，批號：10099-141)；青霉素-鏈霉素溶液(蘇州新賽美公司，批號：C100C5)；達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's modified eagle's medium，DMEM，Gibco公司，批號：C11995500BT)；細胞計數試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8，MedChemExpress公司，批號：HY-K0301)；細胞增殖成像分析試劑盒(Edu試劑盒，銳博生物公司，批號：R11053.10)；凋亡試劑盒(聯科生物公司，批號：AP105)；Trizol裂解液(Invitrogen公司，批號：15596-026)；RIPA裂解液(蘇州新賽美公司，批號：WB3100)；蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合液(蘇州新賽美公司，批號：P002)；轉染培養基 Opti-MEM(Gibco公司，批號：31985070)；脂質體2000(Lipofectamine 2000，Invitrogen公司，批號：11668-019)；抗體SDHD(CST公司，批號：#45849)；抗體AKT(CST公司，批號：4685)；抗體p-AKT(Ser473)(CST公司，批號：4060)；抗體β-actin(CST公司，批號：58169)；抗體GAPDH(CST公司，批號：97166)。

1.2設備與儀器 細胞培養箱(Thermo Scientific公司，型號：BB150)；酶標儀(BIOTEK 公司，型號：ELX-800)；倒置熒光顯微鏡(Leica公司，型號：DMi8)；流式細胞儀(BD公司，型號：Accuri C6)；實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司，型號：ABI QuantStudioTM6 Flex)。

1.3細胞培養 人肝癌細胞株Huh7購自中國科學院生物化學與細胞生物學研究所，后由實驗室保存。人肝癌細胞株Huh7培養于含10% 胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液的DMEM培養基中，并在含5%二氧化碳(CO2)、37 ℃恒溫細胞培養箱中培養。細胞生長達到約80%覆蓋率時進行傳代。

1.4轉染過表達(overexpression，OE)質粒構建SDHD過表達細胞模型 細胞鋪板及預處理：以6孔板為例，取狀態良好的Huh7細胞鋪板，待細胞生長至40%～50%覆蓋率后進行轉染，轉染前2 h換成轉染培養基Opti-MEM進行預處理。質粒稀釋：以100 μL Opti-MEM稀釋OE質粒(4 μL)和Lipofectamine 2000(4 μL)。轉染步驟：兩組稀釋液室溫靜置5 min后混勻，混合液室溫靜置15 min后加入6孔板中，6～8 h更換成正常培養基。48 h后收集細胞并驗證轉染效率，獲得SDHD過表達細胞模型。OE-SDHD序列見表1。

表1 本研究中使用的質粒序列 Tab.1 Oligos used in the research

1.5轉染小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)質粒構建SDHD敲減細胞模型 細胞鋪板及預處理同“1.4”。質粒稀釋：以100 μL Opti-MEM稀釋siRNA(5 μL)和Lipofectamine 2000(5 μL)。轉染步驟同“1.4”。48 h后收集細胞驗證轉染效率，獲得SDHD敲減細胞模型。3組siRNA-SDHD序列見表1。

1.6CCK-8檢測細胞活性 為驗證SDHD過表達對細胞活力的影響，將實驗分為陰性對照組(NC)及SDHD過表達組(OE)。為驗證SDHD敲減對細胞活力的影響，將實驗分為對照組(ctr)及SDHD敲減組(si-2及si-3)。各組細胞以每孔5×103個的密度接種于96孔板中培養24 h。24 h后棄去原始培養基，加入含10% CCK-8的完全培養基100 μL，并繼續孵育2～4 h。孵育結束后在酶標儀波長450 nm下檢測各孔吸光度(A)值。

1.7流式細胞術檢測細胞凋亡情況 為考察瑞戈非尼對肝癌細胞凋亡的影響，將Huh7細胞鋪板并分為空白處理組和不同濃度(2，4，6，8，10 μmol·L-1)瑞戈非尼處理組，處理時間為24 h。為考察過表達SDHD對瑞戈非尼藥物作用下細胞凋亡的影響，分組為NC-control組、OE-control 組、NC-6 μmol·L-1組和OE-6 μmol·L-1組，其中NC-control組及OE-control 組均無藥物處理，NC-6 μmol·L-1組和OE-6 μmol·L-1組均給予6 μmol·L-1瑞戈非尼處理，處理時間為24 h。為考察MK2206對SDHD促瑞戈非尼作用下細胞凋亡的影響，分組為NC組、OE組、OE+SC79組和OE+MK2206組，其中NC組及OE組加入6 μmol·L-1瑞戈非尼處理，OE+SC79組加入6 μmol·L-1瑞戈非尼及5 μmol·L-1SC79處理，OE+MK2206組加入6 μmol·L-1瑞戈非尼及10 μmol·L-1MK2206處理，處理時間為24 h。各組細胞經實驗處理后，消化離心收集細胞沉淀。隨后使用預冷的流式緩沖液重懸，并將細胞懸液轉移至1.5 mL的Ep管中，加入凋亡試劑盒中的凋亡染料混勻后避光染色15 min。染色結束后通過流式細胞儀檢測細胞凋亡。通過計算早期凋亡率與晚期凋亡率的總和分析各組細胞凋亡情況。

1.8蛋白質印跡法(Western blotting，WB)檢測蛋白表達 為檢測瑞戈非尼對SDHD蛋白表達水平的影響，Huh7細胞鋪板后分為空白處理組及6 μmol·L-1瑞戈非尼處理組，經24 h及48 h分別處理后收集細胞樣品。為檢測SDHD過表達細胞模型中SDHD、AKT及p-AKT(Ser473)的表達水平，實驗分為NC組及OE組。為檢測SDHD敲減細胞模型中SDHD、AKT及p-AKT(Ser473)的表達水平，實驗分組為ctr組、si-1組、si-2組及si-3組。細胞收樣后經磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗兩遍，使用含1%蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合液的RIPA裂解后離心獲得蛋白上清液。取樣品蛋白30 μg，依次進行電泳、轉膜、封閉、抗體孵育及顯影操作，使用ImageJ軟件分析目標條帶的灰度值。

1.9實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)檢測mRNA的表達 實驗分為空白處理組及6 μmol·L-1瑞戈非尼處理組，經24 h及48 h分別處理后獲取細胞樣品。細胞樣品首先經Trizol裂解液裂解，依次加入三氯甲烷、異丙醇、75%乙醇處理后獲得RNA溶液并定量。經反轉錄獲得cDNA模板，并以cDNA模板進行RT-qPCR。反應條件為 95 ℃ 30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個循環。引物均由上海新貝生物科技有限公司設計合成，引物序列如表2。

表2 RT-qPCR引物序列 Tab.2 Primer sequence of RT-qPCR

1.10Edu試劑盒檢測細胞增殖情況 實驗分組同“1.6”項。各組細胞培養24 h后，根據Edu試劑盒說明書進行Edu染色2 h。染色結束后去除染色液，PBS輕柔清洗后加入細胞固定液室溫孵育30 min，經PBS清洗后加入含0.5% TritonX-100的PBS孵育10 min。孵育結束后PBS清洗一次，隨后加入1X Apollo?反應液孵育30 min，PBS清洗并加入Edu試劑盒中的1×Hoechst33342 反應液繼續染色。染色結束后于倒置熒光顯微鏡下進行觀察并拍照，記錄陽性細胞率。陽性細胞率為每視野下紅色熒光數與藍色熒光數比值。陽性細胞率越高，細胞增殖能力越強。

1.11GEPIA分析肝癌組織中SDHD與AKT1基因表達的相關性 首先搜索并打開GEPIA在線工具(http：//gepia.cancer-pku.cn/)，點擊選擇“Multiple Gene Analysis”，然后選擇“Correlation Analysis”。依次填寫基因“SDHD”及“AKT1”“TCGA Tumor” 項選擇“LIHC Tumor”并添加到“Used Expression Datasets”中。最后點擊“Plot”輸出結果，分析肝癌組織中SDHD與AKT1基因表達的相關性。

1.12Kaplan Meier-plotter 分析SDHD mRNA表達與肝癌預后的相關性 首先進入Kaplan Meier-plotter網站(http：//kmplot.com/analysis)，點擊“Start KM Plotter for liver cancer”進入參數設置頁面。然后在“Affy id/Gene symbol”對話框中輸入“SDHD”，“Survival”分別選擇“OS”“RFS”，其余選項維持默認值。點擊“Draw Kaplan-Meier Plot”輸出結果，分析SDHD的mRNA表達水平與肝癌患者總生存期(OS)及無復發生存時間(RFS)的相關性。

1.13統計學方法 采用SPSS 20.0版統計軟件對數據進行分析與處理。對于兩組之間差異比較，采用t檢驗。對于多組間差異比較采用單因素方差分析。每組實驗重復3次。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1瑞戈非尼對肝癌細胞凋亡及SDHD表達的影響 見圖1。流式結果顯示，與空白處理組相比，4，6，8，10 μmol·L-1瑞戈非尼處理組細胞凋亡率均升高，且差異有統計學意義(P<0.05，見圖1A-B)。此外，與空白處理組相比，6 μmol·L-1瑞戈非尼24 h 48 h給藥處理均能促進SDHD mRNA及蛋白表達上調(P<0.05，見圖1C-D)。以上結果提示SDHD可能在瑞戈非尼藥物作用下的細胞凋亡過程中發揮重要作用。

A&B.不同濃度瑞戈非尼對Huh7細胞凋亡的影響；C.瑞戈非尼24 h及48 h給藥對SDHD mRNA表達的影響；D.瑞戈非尼24 h及48 h給藥對SDHD蛋白質表達的影響；①P<0.01；②P<0.05。圖1 瑞戈非尼對Huh7細胞凋亡及SDHD表達水平的影響A&B.Effect of different concentrations of regorafenib on cell apoptosis of Huh7；C.Effect of 24 h or 48 h regorafenib treatment on mRNA level of SDHD；D.Effect of 24 h or 48 h regorafenib treatment on protein level of SDHD；①P<0.01；②P<0.05。Fig.1 The effect of regorafenib on cell apoptosis and SDHD expression in

2.2構建SDHD過表達及敲減細胞模型 WB結果顯示，OE組SDHD表達水平高于NC組(t=3.603，P<0.05，見圖2A)，說明SDHD過表達細胞模型構建成功。si-1、si-2和si-3組SDHD表達水平均低于ctr組(P<0.05，見圖2B)，說明SDHD敲減細胞模型構建成功，且si-2和si-3敲減效果更為理想，后續使用si-2及si-3驗證SDHD敲減對細胞增殖的影響。

A.WB驗證SDHD過表達效率；B.WB驗證SDHD敲減效率；①P<0.05；②P<0.01；③P<0.001。圖2 構建SDHD過表達和敲減細胞模型A.The efficiency of SDHD over expression was validated by WB；B.The efficiency of SDHD knockdown was valdated by WB；①P<0.05；②P<0.01；③P<0.001。Fig.2 Construction of SDHD overexpression model and SDHD knockdown

2.3SDHD對肝癌細胞增殖的影響 CCK-8實驗結果顯示，與NC組比較，OE組細胞活力降低(t=4.243，P<0.05，見圖3A)；與ctr組比較，si-2及si-3組細胞活力均增高(P<0.05，見圖3A)。Edu實驗結果顯示，OE組Edu陽性細胞率低于NC組(t=6.736，P<0.05，見圖3B，3D)，si-2及si-3組陽性細胞率均高于ctr組(P<0.05，見圖3C，3E)。以上數據結果提示過表達SDHD 抑制細胞增殖，敲減SDHD促進細胞增殖。

A.CCK-8檢測SDHD對Huh7細胞活力的影響；B&D.Edu實驗檢測過表達SDHD對Huh7細胞增殖的影響；C&E.Edu實驗檢測敲減SDHD對Huh7細胞增殖的影響；①P<0.05；②P<0.01；③P<0.001；④P<0.000 1。圖3 SDHD對Huh7細胞增殖的影響A.Effect of SDHD on the viability of Huh7 cell was quantified by CCK-8；B&D.Effect of SDHD knockdown on the proliferation of Huh7 cell was quantifitecl by Edu；C&E.Effect of SDHD knockdown on the proliferation of Huh7 cell was quantifiecl by Edu；①P<0.05；②P<0.01；③P<0.001；④P<0.000 1.Fig.3 Effect of SDHD on Huh7

2.4過表達SDHD對瑞戈非尼藥物作用下細胞凋亡的影響 流式實驗結果提示NC-control組與OE-control組細胞凋亡率無明顯差異(P>0.05)，但OE-6 μmol·L-1組細胞凋亡率高于NC-6 μmol·L-1(P<0.05)，見圖4A-B。這一結果提示過表達SDHD不影響細胞基礎凋亡率，但能提高細胞在瑞戈非尼作用下的凋亡率。

A&B.流式細胞術檢測過表達SDHD對細胞凋亡的影響；①P<0.000 1。圖4 過表達SDHD對Huh7細胞凋亡率的影響(n=3) A&B.Effect of SDHD overexpresion on cell apoptosis of Huh7 was analyzed by flow cytometry ；①P<0.000 1。Fig.4 Effect of SDHD overexpression on the apoptosis rate in Huh7(n=3)

2.5MK2206對SDHD促瑞戈非尼作用下細胞凋亡的影響 AKT信號通路參與肝癌增殖、遷移、侵襲及耐藥過程[12-14]，對于肝癌發生、發展、耐藥及預后具有重要意義。為明確SDHD對肝癌細胞AKT信號通路的影響，本研究對p-AKT(Ser473)的表達水平進行檢測。WB結果顯示，OE組 p-AKT(Ser473)表達高于NC組(P<0.05，見圖5A)；si-1、si-2和si-3組p-AKT(Ser473)表達均低于ctr組(P<0.05，見圖5B)。以上數據提示SDHD能通過提高p-AKT(Ser473)的表達水平激活AKT信號通路。

隨后采用流式細胞術進一步分析AKT信號通路抑制劑MK2206對SDHD促瑞戈非尼作用下細胞凋亡的影響。結果顯示，與OE組比較，OE+MK2206組細胞凋亡進一步增多(P<0.000 1)，而OE+SC79組的細胞凋亡與OE組無明顯差異，見圖5C-D。以上結果提示MK2206能夠協同SDHD過表達促進肝癌細胞在瑞戈非尼作用下發生凋亡。此外，通過GEPIA網站上的數據庫分析SDHD與AKT1基因表達的相關性。結果顯示，肝癌腫瘤組織中SDHD與AKT1表達呈正相關(P<0.05，R=0.33，見圖5E)，隨著SDHD的表達增多，AKT1的表達也隨之增加。

A.過表達SDHD對AKT信號通路的影響；B.敲減SDHD對AKT信號通路的影響；C&D.流式細胞術檢測SC79和MK2206對SDHD促瑞戈非尼藥物作用的影響；E.肝癌組織中SDHD與AKT1基因表達的相關性；①P<0.05；②P<0.01；③P<0.001；④P<0.000 1。圖5 觀察SDHD對AKT信號通路的影響A.Effect of SDHD overexpression on AKT signaling pathway；B.Effect of SDHD knockdown on AKT signaling pathway；C&D.Effect of SC79 or MK2206 on the promotion of SDHD in regorafenib-related apptosis was analyzed by flow cyrometry；E.Correlation between SDHD and AKT1 gene expression in liver concer；①P<0.05；②P<0.01；③P<0.001；④P<0.000 1.Fig.5 The effect of SDHD on AKT signaling

2.6SDHD mRNA表達水平與肝癌臨床預后的關系 通過分析Kaplan Merier-plotter網站的數據發現高表達SDHD患者組的總生存期(overall survival，OS)及無復發生存時間(recurrence free survival，RFS)長于低表達SDHD患者組(P<0.05，見圖6A-B)，提示高表達SDHD的肝癌患者預后更好。

A.SDHD表達與肝癌患者OS的相關性；B.SDHD表達與肝癌患者RFS的相關性。圖6 SDHD表達高低與肝癌臨床預后的關系 A.Representatior of overall survival depending on SDHD expression in patients with liver cancer；B.Representation of recurrence free survival depending on SDHD expression in patients with liver cancer.Fig.6 Relationship between SDHD and clinical prognosis in HCC

3 討論

肝細胞癌是高復發、難治愈的惡性腫瘤之一，其5年生存率僅為18%。晚期肝癌的首選治療藥物索拉非尼雖然具有一定的臨床療效，但耐藥的出現給肝癌治療帶來了巨大挑戰。臨床Ⅲ期實驗表明索拉非尼耐藥后采用瑞戈非尼進行治療能夠在一定程度上提高肝癌患者的總生存期[15]。但隨著研究進一步深入，瑞戈非尼耐藥問題也日漸凸顯：SphK2/S1P通過激活NF-κB和STAT3介導肝癌瑞戈非尼耐藥[16]；ADAMTSL5作為主要的調節因子參與肝癌瑞戈非尼耐藥[17]。因此，繼續挖掘肝癌治療的新靶點具有重要的臨床意義。

SDHD作為琥珀酸脫氫酶復合體中的關鍵亞單位，通過影響PTEN-AKT-FOXO3a軸參與甲狀腺癌的腫瘤調控過程[10]。已有文獻報道SDHD參與TGF-β介導的骨肉瘤化療耐藥：TGF-β引起SDHD表達下調，并通過上調HIF-1α引起骨肉瘤化療耐藥[11]。然而，SDHD在肝癌中的作用尚未完全闡明。本研究通過驗證瑞戈非尼對肝癌細胞凋亡及SDHD表達的影響，探索SDHD對肝癌細胞增殖及瑞戈非尼藥物作用的影響，提示SDHD或許是肝癌治療的新靶點。

肝癌細胞的增殖能力與藥物作用下的細胞凋亡水平在一定程度預示著腫瘤的生長及藥物治療效果。本研究發現瑞戈非尼在誘導細胞凋亡的過程中引起SDHD表達上調，提示SDHD可能是瑞戈非尼刺激下的積極響應因子。隨后發現過表達SDHD抑制細胞增殖，同時提高細胞在瑞戈非尼藥物作用下的凋亡率。結合臨床大數據分析SDHD與肝癌患者總生存期及無復發生存時間的關系，發現高表達SDHD的肝癌患者預后更好，提示SDHD發揮抑癌因子的作用。

AKT信號通路參與調控多種惡性腫瘤的發生、發展、遷移、耐藥及復發過程，是經典的腫瘤信號通路[18-20]。AKT存在2個磷酸化位點，分別為Thr 308位點及Ser 473位點。AKT被磷酸化激活后促使一系列底物磷酸化，進而調節細胞增殖、生長及代謝過程[21，22]。文獻報道瑞戈非尼處理能夠激活肝癌細胞AKT信號通路，瑞戈非尼聯合駱駝蓬堿能夠通過抑制AKT信號通路進一步殺傷細胞[23]。此外，結腸癌細胞瑞戈非尼耐藥株在瑞戈非尼刺激后激活AKT信號通路[24]；瑞戈非尼誘導非小細胞肺癌腫瘤干細胞富集及耐藥依賴于AKT/FOXM1/STMN1 信號通路的激活[25]。以上文獻提示瑞戈非尼刺激引起AKT信號通路激活，瑞戈非尼耐藥與AKT信號通路激活之間存在十分重要的聯系。本研究發現瑞戈非尼刺激引起肝癌細胞SDHD表達增多，隨后通過WB實驗發現外源過表達SDHD提高p-AKT(Ser473)的表達，而敲減SDHD降低p-AKT(Ser473)的表達，這表明SDHD能通過磷酸化AKT激活該信號通路。此外，本研究還發現AKT信號通路激動劑不影響SDHD過表達對瑞戈非尼誘導細胞凋亡的促進作用，這可能是由于SDHD已經激活了AKT信號通路，在此基礎上再次激活AKT信號通路則不會進一步誘導細胞凋亡；反之，抑制AKT通路能夠協同SDHD過表達進一步提高細胞在瑞戈非尼作用下的凋亡水平。

綜上所述，本研究發現瑞戈非尼促進肝癌細胞凋亡，提高SDHD的表達水平，過表達SDHD能抑制肝癌細胞增殖，提高細胞在瑞戈非尼作用下的凋亡水平。SDHD可能是肝癌治療的潛在靶點，但其具體機制仍需進一步闡明。