坎地沙坦酯P123/F127混合膠束給藥系統的構建及表征*

莫一燕，孫敬蒙，房辰晨，賈珍珍，張鑫，張煒煜

(1.長春中醫藥大學藥學院，長春 130117；2.吉林大學第一醫院臨床藥學部，長春 130021)

坎地沙坦酯(candesartan cilexetil，CC)是一種選擇性阻斷血管緊張肽Ⅱ受體拮抗藥[1]，與AT1受體結合能力強，解離速度慢，從而抑制AT1的作用，用于治療高血壓，并其對患者的腎功能有一定的維護和改善作用，且能減少糖尿病患者和輕度蛋白尿患者的尿蛋白排泄。但CC為水難溶性藥物，其生物利用度低，僅約為15%[2]。近年來，CC的國內用藥量逐步增加，市售劑型包括片劑、分散片等，然而市售片劑普遍存在口服生物利用度低的缺點，需要改善吸收，提高生物利用度[3]。KAMALAKKANNAN等[4]將其制備成脂質微球，但體外釋放實驗表明藥物非勻速釋放，且脂質微球給藥系統容易產生突釋現象，易造成血藥濃度劇烈波動，損傷人體器官。將CC制備成固體脂質納米粒[5]、納米乳[6]、自微乳[7]等新劑型的制備工藝較繁瑣或制劑不穩定，不易于工業化生產，而聚合物膠束易于制備、易于載藥、易于載到病灶部位。

近年來，聚合物膠束作為納米藥物載體成為研究熱點而備受關注。目前，相關制劑已被批準使用或進入臨床試驗階段[8-10]，HOU等[11]研究證明了聚合物膠束具有提高紫杉醇口服生物利用度的巨大潛力。聚合物膠束是由兩親嵌段共聚物自組裝形成納米級殼-核結構，疏水的PPO鏈段形成膠束的內核，疏水內核能夠通過疏水相互作用和π-π鍵相互作用與難溶性藥物結合，將難溶性藥物增溶與內核中，從而提高藥物的溶解度，同時還可以避免在生物環境中藥物失活。親水的PEO鏈段形成膠束的外殼，能避免被吞噬和被蛋白質和細胞吸附[12]。聚合物膠束粒徑小(10～100 nm)，可以增強疏水性藥物分子的穩定性，在藥物的增溶方面表現出非常好的應用前景[13]。而混合膠束能通過協同不同嵌段共聚物發揮各自特點和作用，很好地解決由于單一聚合物形成的聚合物膠束通常面臨載藥量低、穩定性差等問題[10]。筆者選用了具有兩親性三嵌段共聚物的泊洛沙姆P123(Pluronic P123)和F127(Pluronic F127)作為載體材料，具有生物相容性好、毒副作用弱、低免疫原性、低抗原性和良好的藥物增溶能力等優點[14]。本研究通過優化處方制備坎地沙坦酯P123/F127混合膠束，增加CC的溶解度，促進CC的吸收。

1 儀器與材料

1.1儀器 1200型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；TGL-18C高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)；RE-52AA旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)；Zetasizer Nano ZS型動態光散射儀(英國Malvern公司)；DSC3差示掃描量熱儀(梅特勒-托利多儀器有限公司)；H-7650透射電子顯微鏡(HITACHI公司)；VECTOR-33型傅立葉變換紅外光譜儀(德國Bruker公司)。

1.2材料與試劑 坎地沙坦酯原料藥(珠海潤都股份有限公司，批號：56713040205，含量：≥99%)；坎地沙坦酯對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：100685-201602，含量：99.8%)；Pluronic F127(Sigma公司，批號：101856315)；Pluronic P123(Sigma公司，批號：102142834)；甲醇、乙腈(色譜純，Sigma公司)；無水乙醇(化學分析純，北京化工廠)。

2 方法與結果

2.1坎地沙坦酯混合膠束的制備 采用薄膜水化法制備坎地沙坦酯混合膠束(CC-MMs)[15]。精密稱取處方量的CC原料藥、Pluronic P123和F127，加入無水乙醇，超聲溶解，置于250 mL圓底燒瓶中，在一定溫度下減壓旋轉蒸發除去有機溶劑，形成透明均勻的藥膜，真空干燥過夜。加入適量純化水，在一定溫度下水化45 min，過孔徑0.22 μm有機微孔濾膜，即得澄清透明并帶有藍色乳光的CC-MMs溶液。

2.2坎地沙坦酯含量測定方法的建立

2.2.1色譜條件 以Agilent XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)為色譜柱，甲醇-水-磷酸(體積比85：15：0.01)為流動相，檢測波長為254 nm，柱溫為30 ℃，流速為1 mg·mL-1，進樣量為20 μL。

2.2.2標準曲線的建立 精密稱取坎地沙坦酯對照品6.4 mg，置于10 mL的量瓶中，加甲醇定容，制得濃度為0.64 mg·mL-1的坎地沙坦酯對照品溶液。精密量取對照品溶液，加甲醇稀釋成坎地沙坦酯質量濃度分別為0.01，0.02，0.04，0.08，0.16，0.32，0.64 mg·mL-1的對照品溶液，注入液相色譜儀進行測定。以峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標，得出回歸方程：Y=34 940X+35.838，r=0.999 9，表明坎地沙坦酯在0.01～0.64 mg·mL-1范圍內線性關系良好。

2.2.3重復性、精密度、穩定性、回收率 按相關方法操作，得重復性實驗中樣品含量的RSD為0.50%(n=6)；精密度實驗中低、中、高質量濃度對照品溶液的日內RSD分別為0.45%，0.77%，0.55%(n=5)，日間RSD分別為1.30%，1.40%，0.70%(n=5)；穩定性實驗(24 h)中含量的RSD為0.96%(n=8)；回收率實驗中低、中、高質量濃度的加樣回收率分別為99.03%，100.6%，99.3%，RSD分別為2.05%，0.4%，1.47%(n=3)。經考察，所建立的檢測方法準確可靠。

2.3包封率、載藥量和沉降率的測定 包封率和載藥量的測定：參照文獻[16]介紹的方法測定包封率和載藥量。取適量CC-MMs溶液，12 000 r·min-1下離心20 min(r=4 cm)。取上清液濾過，以除去雜質和未被包封的藥物，得到純化的CC-MMs溶液。精密量取純化的CC-MMs溶液1 mL，置于10 mL量瓶中，加入適量甲醇，超聲10 min以破壞膠束結構，甲醇定容，經孔徑0.22 μm微孔濾膜濾過，高效液相色譜(HPLC)法測定CC含量，計算CC-MMs的包封率(EE)：EE(%)=m1/m2×100%，載藥量(DL)：DL(%)=m1/(m1+m3)×100%。式中m1為載藥膠束溶液中藥物的含量，m2為投藥量，m3為載體材料總質量。

沉降率的測定：膠束體系在一定時間內的藥物析出量能夠反映膠束的穩定性，所以將藥物沉降率作為考察指標之一。將新鮮制備的CC-MMs溶液置于4 ℃下48 h[17-20]，12 000 r·min-1下進行離心20 min(r=4 cm)，分離膠束和析出結晶藥物，精密量取上清液1 mL，加甲醇破乳，超聲10 min破壞膠束結構，定容，0.22 μm微孔濾膜濾過并測定48 h后膠束中所含藥量，計算CC-MMs沉降率。沉降率=(m0-m48)/m0×100%。式中m0為新鮮制備的CC-MMs中藥物的含量，m48為4 ℃環境下放置48 h后CC-MMs中藥物含量。

2.4單因素實驗 按“2.1”項下的制備方法，以EE、DL及沉降率為考察指標，通過單因素實驗考察載體Pluronic 123質量百分比(25%，33.3%，50%，66.7%，75%)、Pluronic P123/F127混合載體用量(90，120，150，180，210 mg)、水化溫度(30，35，40，50，60 ℃)、水相體積(3，6，9，12，15 mL)、旋轉蒸發溫度(25，35，45，55，65 ℃)、有機溶劑用量(1，2，3，4，5 mL)的影響。經單因素實驗，綜合考慮，最終確定無水乙醇用量為3 mL、旋轉蒸發溫度為45 ℃、水化溫度為40 ℃。而載體Pluronic 123與F127的比例、Pluronic P123/F127混合載體用量和水相體積對EE、DL及沉降率均有明顯的影響，因此將它們作為待優化項進行星點設計-效應面法實驗。

2.5星點設計-效應面法優化

2.5.1星點實驗設計 根據預單因素實驗考察結果，選擇載體Pluronic 123質量百分比(A)、P123/F127混合載體用量(B)、水相體積(C)3個顯著因素作為自變量，以EE%(Y1)、DL%(Y2)及沉降率(Y3)為考察指標，因素水平見表1。應用Design Expert 8.0.5b軟件，進行試驗設計，見表2。采用以下公式求得總評歸一值(OD)，進行各指標的綜合評價：

表1 因素水平 Tab.1 Factor level

OD=(d1×d2×d3)1/3

式中，d1、d2、d3分別為EE、DL及沉降率的歸一值，Yi為實測值，Ymin和Ymax為實驗中各因變量的最小值和最大值。

2.5.2模型擬合及方差分析 應用Design Expert 8.0.5b軟件分析表2數據，進行線性回歸、擬合并進行方差分析，得到回歸方程：OD=0.68+0.13A+0.11B-0.074C-0.057AB-0.075AC-0.040BC-0.030A2-0.16B2-0.14C2(R2=0.904 1)。

表2 試驗設計與結果 Tab.2 Experimental design and results

方差分析結果如表3所示。結果表明該回歸模型差異有統計學意義(P=0.000 5)，F值為10.47，失擬值無顯著性，表明建立的模型可靠，擬合情況良好。結果表明A、B、C、B2、C2對OD值的影響均顯著，二次項A2及交互項AB、AC、BC對OD值的影響均不顯著。根據上述回歸模型繪制三維效應面圖和二維等高線圖，如圖1—3所示。軟件分析優化得到CC-MMs的最優處方：Pluronic P123質量百分比為66.7%，P123/F127混合載體用量為158.2 mg，水相體積為8.40 mL。

表3 方差分析 Tab.3 Analysis of variance

圖1 P123質量百分比及P123/F127混合載體用量對OD值的影響 Fig.1 P123 mass percentage and the amount of P123/F127 mixed carrier on OD value

圖2 水相體積及P123質量百分比對OD值的影響 Fig.2 Effect of water phase volume and P123 mass percentage on OD value

圖3 水相體積及P123/F127混合載體用量對OD值的影響 Fig.3 Effects of aqueous phase volume and amount of P123/F127 mixed carrier on OD value

2.5.3優化處方工藝的驗證 在預測的最佳工藝條件下制備3批CC-MMs溶液，取平均值與預測值進行比較。測得包封率為(94.79±1.48)%，載藥量為(5.76±0.08)%，沉降率為(2.34±0.09)%(n=3)，OD值(0.74±0.02%)(n=3)，實測值與預測值的偏差較小且工藝重復性好，說明所建立的模型合理可靠性。

2.6坎地沙坦酯混合膠束的表征

2.6.1臨界膠束濃度的測定 將碘(I2)100 mg和碘化鉀(KI)200 mg溶解在10 mL純化水中，混勻，制得KI/I2標準溶液，避光備用。分別將P123/F127混合載體(P123質量百分比為66.7%)、F127和P123制備成濃度為0.000 01～0.1 g·(100 mL)-1的系列濃度的水溶液。取制備好的不同濃度的樣品4 mL，分別向其中加入配備好的KI/I2標準溶液20 μL，搖勻，在測量之前，將混合物置于室溫下在避光處放置24 h，使碘的分配達到平衡。在366 nm波長處測定不同濃度的P123/F127混合載體、F127和P123水溶液的吸光度，繪制曲線，見圖4所示，P123/F127混合載體、單一P123和單一F127膠束的臨界膠束濃度(CMC)值分別為0.005 9，0.007 0和0.003 7 g·(100 mL)-1，其中F127膠束和P123膠束的CMC值與文獻[21]中先前測定的CMC值一致，P123/F127混合膠束的CMC介于F127和P123膠束之間。P123/F127混合膠束相較于P123膠束具有更低的CMC值，表現出較高的穩定性和較好的抗稀釋能力，在進入體內后能較長時間保持膠束結構的完整性。

圖4 碘的吸光度值與P123(A)、F127(B)及P123/F127(C)膠束濃度對數(logC)的關系曲線圖 Fig.4 The relationship between the absorbance value of iodine and the logarithm of micelle concentration (logC) of P123 (A)，F127 (B) and P123/F127 (C)

2.6.2形態、粒徑、PDI與 Zeta 電位的測定 取優化工藝制備的CC-MMs溶液一滴，于銅網上吸附3 min后，用2%磷鎢酸負染5 min，自然揮干，加速電壓90 kV，置透射電鏡下觀察微觀形態，結果見圖5可見CC-MMs的形態規整，呈球形，分布均一，無聚集。

圖5 CC-MMs(×40 000)的透射電鏡圖 Fig.5 CC-MMS(×40 000)transmission electron microscopy

取優化工藝制備的CC-MMs溶液，于動態光散射儀樣品池中，采用動態光散射法進行測量CC-MMs的粒徑、PDI及Zeta電位，結果見圖6，7。CC-MMs的平均粒徑、PDI和Zeta電位分別為(26.39±0.22) nm、0.210±1.49和(-21.57±0.71) mV。動態光散射法測得的是CC-MMs的水合徑，而透射電鏡測的是CC-MMs在干燥狀態下的粒徑，因此所測結果有略微的差異。

圖6 CC-MMs的粒徑分布 Fig.6 Particle size distribution of CC-MMs

圖7 CC-MMs的Zeta電位圖 Fig.7 Zeta potential diagram of CC-MMS

2.6.3差示掃描量熱分析(DSC) 分別取Pluronic P123、Pluronic F127、Pluronic P123/F127物理混合物、CC原料藥、空白膠束凍干粉及CC-MMs凍干粉進行DSC分析。工作條件：以空鋁坩為空白參考池，樣品約3～5 mg，置于機器中進行圖譜掃描，N2作為吹掃氣，流速為50 mL·min-1，掃描范圍5～220 ℃，升溫10 ℃·min-1，結果見圖8和9。

A.P123；B.F127；C.P123/F127物理混合物；D.空白膠束。圖8 差示掃描量熱分析的DSC曲線測定結果 A.Pluronic P123；B.Pluronic F127；C.Pluronic P123/F127 physical mixture；D.Blank micelles.Fig.8 DSC curve of differential scanning calorimetry

A.CC原料藥；B.空白膠束；C.混合膠束凍干粉。圖9 差示掃描量熱分析的DSC曲線測定結果 A.CC API；B.Blank micelles；C.Mixed micellar lyophilized powder.Fig.9 DSC curve of differential scanning calorimetry

由圖8和9可知，Pluronic P123在19.23 ℃和41.92 ℃處有兩個吸熱峰，Pluronic F127在59.31 ℃存在一個較大的吸熱峰，分別對應了Pluronic P123和F127的熔點。在P123/F127物理混合物的DSC曲線中，Pluronic P123和F127的熔點峰仍然存在，而空白膠束凍干粉DSC譜圖中只存在一個吸熱峰為54.20 ℃，呈現單峰分布，并且介于P123與F127的熔點峰之間。說明混合的Pluronic P123/F127系統表現出協同結合作用，形成了穩定的混合膠束結構。CC在171.56 ℃處有一個較大的吸熱峰，為CC的熔點峰，而在載藥膠束的DSC圖譜中CC特征熔點峰消失，且峰值發生變化，表明藥物完全被嵌入到膠束內核中，表明CC-MMs制備成功。

2.6.4傅里葉-紅外光譜(FT-IR)分析 用FT-IR測定CC原料藥、空白膠束和CC-MMs的紅外吸收光譜。采用溴化鉀(1：100比例)制備樣品，將制備好的樣品置于樣品架上，在4000～400 cm-1區間內掃描，結果見圖10。圖10顯示，2940，1475 cm-1為CC原料藥的-CH3的特征吸收峰，1753 cm-1為-C=O的特征吸收峰，990 cm-1為坎地沙坦酯結構中環己氧基的伸縮振動峰，3028，1475，750 cm-1為苯環的特征吸收峰，1242 cm-1為-C-N-的伸縮振動峰。在空白膠束譜圖中，3420 cm-1為Pluronic P123和F127結構中-OH的伸縮振動峰，2871，1374 cm-1為-CH2的特征吸收峰，2958，1455 cm-1為-CH3的特征吸收峰，1105 cm-1為-C-O-的伸縮振動峰，939 cm-1為-CH-CH2的伸縮振動峰。在CC-MMs的譜圖中，-OH的吸收峰由3420 cm-1變為了3462 cm-1，-CH3吸收峰由2940 cm-1變為了2956 cm-1，-C=O的特征吸收峰由1753 cm-1變為了1702 cm-1，說明CC原料藥中的-CH3、-C=O與Pluronic P123和F127中的-OH之間形成了氫鍵，從而增加了藥物的溶解度，且載藥膠束的光譜中不存在坎地沙坦酯的特征峰進一步說明CC進入膠束疏水內核。

A.原料藥；B.空白膠束；C.CC-MMs。圖10 不同樣品的紅外光譜圖 A.API；B.Blank micelles；C.CC-MMs.Fig.10 Infrared spectra of different samples

2.6.5CC-MMs與P123和F127單一膠束比較 分別取P123與F127載藥膠束溶液適量，分別按照“2.3”項下進行EE、DL及沉降率的測定，及按照“2.6.2”項下測定其粒徑、PDI以及Zeta電位，結果見表4。表4表明，相對于單一P123膠束或F127膠束，P123和F127所形成的混合膠束體系更穩定，且具有更高的EE及DL，更小的粒徑及PDI。

表4 CC-MMs與P123、F127單一膠束的比較結果 Tab.4 Comparison results of CC MMS with P123 and F127 single micelles

2.6.6飽和溶解度的測定 取過量的CC、CC-MMs凍干粉于離心管中，分別加入一定量的純化水、pH值6.8的緩沖液，在25 ℃水浴中振蕩24 h(100 r·min-1)，12 000 r·min-1，離心20 min(r=4 cm)，取上清液濾過，按“2.2.1”項色譜條件測定CC含量。測得在純化水中和pH值6.8緩沖液中CC原料藥的飽和溶解度分別為1.5和2.1 μg·mL-1，而載藥膠束在純化水和pH緩沖液中的飽和溶解度增至1650和1640 μg·mL-1，表明坎地沙坦酯P123/F127混合膠束可以顯著提高CC的溶解度。

3 討論

優化處方制備的CC-MMs的粒徑較小，形態為分布均勻的球形，符合形成聚合物膠束的要求。且P123/F127所形成的CC-MMs相對于單一P123膠束或F127膠束，CMC值更低，更穩定，具有更高的包封率及載藥量，更小的粒徑及PDI。可能是由于P123具有較長的疏水PPO鏈段，其增溶能力較強，形成的膠束內核可以包載更多的藥物，因此其所形成的膠束包封率較高，但由于P123的親水鏈段較短，導致其容易團聚，所形成的膠束穩定性較差，導致其沉降率較大。而F127具有較長的親水鏈，雖然能增加膠束的空間穩定性，但由于其所形成的疏水核心體積較小，因此其包封率及載藥量較低。綜上所述，P123/F127混合膠束可以提高CC的溶解性能。通過協同發揮泊洛沙姆P123和F127的特點和作用，實現對疏水性藥物CC進行裝載并對處方工藝優化。為實現納米制劑的長期保存以及大大降低聚合物納米膠束制劑中的水含量，提高穩定性，將采用凍干技術制備成坎地沙坦酯納米膠束凍干粉，為進一步研究提供給藥方式。

隨著各種新型兩親性嵌段共聚物的發展，基于膠束的藥物遞送系統已成為潛在的納米藥物遞送技術，并在很多領域取得了重大進展。聚合物膠束易于制備、易于載藥、易于載到病灶部位，再加上智能化，相信今后會有更多的膠束制劑從理論設計應用到臨床治療中。