20份馬鈴薯品種(系)指紋圖譜構建和遺傳多樣性分析

劉毅強， 田再民， 祁利潘， 龔學臣， 馮 琰， 張云帥， 翟鑫娜， 蘇晨晨， 柴國柱， 王 然

(河北北方學院，河北張家口 075000)

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)屬于茄科(Solanaceae)茄屬(Solanum)一年生草本植物，是以塊莖為食物的糧菜兼用作物。據2017年聯合國糧食及農業組織(FAO)統計，中國馬鈴薯種植面積、產量分別占世界的29.88%、25.56%，是種植面積和產量最大的國家[1]。馬鈴薯的遺傳多樣性可以從很多方面體現，包括形態特征、生理特征、細胞特征和DNA序列等，其中遺傳多樣性的本質是DNA多樣性[2]，因此，應用分子標記技術對馬鈴薯進行DNA標記和遺傳差異性分析顯得至關重要。簡單重復序列(simple sequence repeat，簡稱SSR)是一種應用較廣泛的分子標記技術，該技術具有低成本、操作簡單、重復性好、多態性高等優勢，被廣泛應用于新品種選育和遺傳多樣性研究[3-4]。de Galarreta等通過SSR分子標記聚類分析的方法，把西班牙當地105個馬鈴薯品種中具有相似特性的品種聚在了一起[5]。de Haan等利用SSR標記技術，比對了1 162份來自秘魯中部的地方品種及外遷地方品種，通過15對SSR引物檢測到173個等位位點[6]。谷青等利用5對SSR引物對河北省、黑龍江省、遼寧省、寧夏回族自治區和內蒙古自治區5個地區的74株馬鈴薯早疫病病菌進行SSR標記，共檢測到26個等位位點[7]。李靚等利用10對SSR引物擴增6份馬鈴薯新品系，共擴增出105個等位位點，其中多態性位點82個，多態性比率為78.1%[8]。李建武等利用11對多態性高、譜帶清晰SSR的引物分析了甘肅省42份馬鈴薯主栽品種的遺傳多樣性，結果表明，42份馬鈴薯品種之間的遺傳基礎較狹窄，遺傳相似性較高[9]。李國彬等利用SSR引物和細胞質DNA引物對云南省79份馬鈴薯品種進行遺傳多樣性分析，分析了不同馬鈴薯品種的細胞質類型并構建了指紋圖譜[10]。種質資源鑒定、資源收集、種質保存和創新利用是拓展品種遺傳基礎、不斷提高育種水平的重要條件和緊迫任務[11-12]。SSR分子標記技術在馬鈴薯的遺傳多樣性研究和種質資源鑒定的應用已逐漸成熟，本研究利用形態學鑒定和SSR分子標記鑒定技術對20份馬鈴薯材料進行遺傳多樣性分析，解析品種間的親緣關系，并初步構建了20份馬鈴薯材料的指紋圖譜，為馬鈴薯種質資源的保護利用、親緣關系分析及品種鑒定提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

20份馬鈴薯材料來自國際馬鈴薯研究中心(CIP)、中國農業科學院蔬菜花卉所、河北北方學院旱作農業研究中心等馬鈴薯選育單位(表1)。

1.2 試驗地點

試驗于2021年5—9月在河北省張家口市河北北方學院馬鈴育種試驗基地(114°21′20.69″)進行。該地區屬中溫帶大陸性季風氣候，海拔1 600～1 800 m，年降水量300 mm左右。試驗地為栗鈣土，土壤肥力中等，年平均日照時數2 897.8 h。

1.3 試驗方法

選取20份馬鈴薯品種(系)，隨機排列種植，每份品種(系)種植面積108 m2(30 m×3.6 m)，起壟種植，壟寬90 cm，種植密度52 500株/hm2。播種前施復合肥(N ∶P2O5∶K2O=1 ∶0.5 ∶2.5)1 500 kg/hm2，不追肥，正常田間管理，2021年5月7日播種，9月18日收獲。

表1 供試馬鈴薯品種(系)資源

1.4 測定項目及方法

1.4.1 田間表型性狀調查及賦值方法 參考《馬鈴薯種質資源描述規范和數據標準》[13]和《馬鈴薯DUS測試指南》的分級標準[14]，對供試材料19個田間性狀進行調查并賦值，具體性狀及賦值方法見表2。采用SPSS 22.0統計軟件，通過描述統計模塊，對所有形態學性狀鑒定的數據進行標準化處理，之后將標準化的數據輸入處理軟件SPSS 22.0，采用歐氏距離，利用UPGMA法對供試材料進行聚類，生成聚類圖。

1.4.2 馬鈴薯基因組DNA的提取與SSR-PCR擴增 摘取未感病蟲害的馬鈴薯幼嫩葉片，采用改良的CTAB法提取基因組DNA。12對SSR引物均來自段艷鳳等馬鈴薯科研工作者公開發表的文獻[15]，由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成(表3)，用于對供試馬鈴薯材料進行擴增。PCR擴增體系為 25 μL，包括模板DNA 2 μL、GreenTaqMix 10 μL(來自南京諾唯贊生物科技有限公司)、上下游引物各 1 μL、ddH2O 11 μL。擴增程序為94 ℃預變性 5 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環；72 ℃延伸 10 min。用6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產物，恒定電壓1 800 V，電泳時間90 min，并用硝酸銀染色，氫氧化鈉顯色，拍照記錄結果。

表2 19個馬鈴薯田間性狀及其賦值方法

1.4.3 SSR分子標記聚類分析 以12對SSR引物對供試材料進行擴增，采取人工的方法對擴增出的條帶進行統計，在相同的位置，擴增遷移出條帶的記為“1”，無條帶或條帶模糊的記為“0”，構成(1，0)矩陣。使用軟件NTSYS 2.10進行遺傳距離分析，計算供試材料之間的遺傳距離，并使用UPGMA進行聚類分析，繪制聚類圖。

2 結果與分析

2.1 基于19個表型性狀的聚類分析

基于歐氏距離按UPGMA方法，對20份馬鈴薯品種(系)的19個基本形態學性狀進行聚類分析研究(圖1)。結果表明，在歐氏距離19.6處可將供試材料分為3個類群。第Ⅰ類包括4份材料，分別為萬紫千紅、BJ16、隴薯309、宣薯4號；第Ⅱ類包括2份材料， 分別是東農311、云薯1號；其他14份材料聚為第Ⅲ類。

表3 12對SSR引物信息

2.2 12對SSR引物擴增結果分析

以20份馬鈴薯品種(系)的DNA為模板，利用12對多態性豐富、條帶清晰的SSR引物對其DNA進行擴增，結果見圖2和表4。12對SSR引物共擴增出91個等位位點，其中多態性位點87個，多態性比率95.6%，平均每對引物擴增7.6個等位位點，7.3個多態性位點。12對SSR引物擴增出的等位位點在3～20個之間，多態性位點在1～19個之間，多態性比率在33.3%～100.0%之間。

2.3 20份馬鈴薯材料的遺傳距離分析

使用NTSYS 2.10軟件計算遺傳距離(表5)，20份馬鈴薯品種(系)間的遺傳距離范圍在0.148 1～0.655 2，平均遺傳距離0.486 9，說明供試材料的遺傳背景差距明顯。其中遺傳距離最近的是荷十四、中薯18號，遺傳距離為0.148 1，遺傳距離最遠的是2014-89-47、麗薯6號，遺傳距離為0.655 2。

2.4 基于SSR分子標記的聚類分析

SSR分子標記聚類分析(圖3)結果表明，20份馬鈴薯品種(系)的聚類結果與其遺傳關系基本保持一致，在遺傳相似系數為0.51時，可將供試材料分為3個類群。第Ⅰ類包括萬紫千紅1份材料； 第Ⅱ類包括2014-89-61、2014-89-47、2011-5-21、BJ16、宣薯4號、荷十四、晉薯15號、中薯18號8份材料；第Ⅲ類包括夏坡蒂、隴薯309、東農311、德薯3號、青薯168、定薯1號、天薯12號、畢薯4號、蒙薯19號、麗薯6號、云薯1號11份材料。

表4 12對SSR引物擴增結果

2.5 20份馬鈴薯材料的指紋圖譜構建

根據SSR引物標記結果，挑選出多態性好、條帶清晰、重復性高的SSR引物，構建20份馬鈴薯材料指紋圖譜。引物STM1052可以鑒別夏坡蒂、2014-89-61、萬紫千紅、BJ16、東農311、德薯3號、宣薯4號、天薯12號、畢薯4號、蒙薯19號、中薯18號、麗薯6號12份供試材料；引物S25可以鑒別萬紫千紅、2011-5-21、BJ16、東農311、德薯3號、畢薯4號、蒙薯19號、麗薯6號8份供試材料；結合引物STM1052和引物S25的擴增結果構建指紋圖譜(表6)，可以把20份供試材料完全區分開。

表6 20份供試馬鈴薯材料的SSR指紋圖譜

3 討論與結論

表型性狀聚類結果表明，表型性狀聚類分析可以較為準確地區分具有顯著形態差異的馬鈴薯材料，如在表型聚類中，類群Ⅰ的材料花繁茂、薯皮光滑、分支數少等；類群Ⅲ的材料絕大多數植株高、單株產量高、葉綠素含量高等。在徐敏的研究結果中，表型聚類的群體3中的材料薯形圓形、薯皮黃色、芽眼較深，群體4花繁茂性強、花粉量大、薯肉為白色[16]，本研究結果與之相似。

SSR分子標記聚類結果表明，地理來源不同的馬鈴薯材料，在聚類圖中也可能被聚合為一類，如荷十四、晉薯15號、中薯18號被聚合在類群Ⅱ；德薯3號、天薯12號、蒙薯19號被聚合在類群Ⅲ，與王鵬等的研究中，天薯12號、蒙薯19號被聚合在一個類群結果[17]相似。同一育種單位選育的馬鈴薯材料遺傳差異較小，如由河北北方學院旱作農業研究中心育成的材料2014-89-61、2014-89-47、2011-5-21親緣關系較近，張招娟等研究發現，品種間親緣關系的遠近程度與育種單位有一定的相關性[18]，本試驗結果與之相近。

大多數馬鈴薯材料在表型性狀聚類圖上和SSR標記聚類圖上都被聚到一個類群當中，如青薯168、定薯1號、天薯12號、畢薯4號、蒙薯19號、麗薯6號在2種聚類圖中都聚合到一起，2014-89-61、2014-89-47、2011-5-21在2種聚類圖中也都聚合到一起。表明SSR分子標記聚類分析結果和表型性狀聚類分析結果具有一定的一致性，植物表型性狀的差別也能夠相應反映基因水平的差別。部分馬鈴薯材料在2種聚類分析結果上表現出差異，劉福翠等研究認為，外界環境的改變容易使馬鈴薯性狀發生改變，從而使馬鈴薯基因型發生變異，表現型發生變化，最終導致SSR分子標記結果與形態學標記結果產生差別[19]。段紹光等研究表明，馬鈴薯是同源四倍體，其高度雜合的特性，決定了表型性狀聚類分析不能從本質上反映馬鈴薯的遺傳差異，只能反映出不同材料之間表型性狀的差異[20]。本試驗SSR分子標記聚類圖中萬紫千紅與其他材料親緣關系較遠，單獨聚為一類，而在表型性轉聚類圖中萬紫千紅、BJ16、隴薯309、宣薯4號則被聚為一個類群，產生此結果的原因可能是土壤、水、氣候等不同環境因素共同影響了植物的形態學性狀，導致2種聚類分析結果產生差異。

本試驗采用20份馬鈴薯品種(系)為供試材料，通過19個表型性狀和12對SSR引物對供試材料進行了表型性狀聚類分析和SSR分子標記聚類分析，并利用2對核心引物(STM1052和S25)構建了供試材料的DNA指紋圖譜，為馬鈴薯種質資源的利用、親緣關系分析及品種鑒定提供了理論依據。