枇杷植株對木霉P3.9菌株及枇杷根腐病病菌的激素響應

魯海菊， 朱海燕， 熊欣燕， 張曉永， 謝 昆

(1.紅河學院生物科學與農學學院，云南蒙自 661199； 2.南寧漢和生物科技股份有限公司，廣西南寧 530000)

枇杷(Eriobotryajaponica)為云南省蒙自市特色經濟水果之一，已成為當地農民脫貧致富的重要途徑。近年來，土傳真菌性病害枇杷根腐病在云南省蒙自市普遍嚴重發生[1]，每年帶來近千萬元的經濟損失。在農業防治和化學藥劑對當地枇杷根腐病害控制效果均不理想的情況下，生物防治有望成為一種綠色有效的控制方法。魯海菊等從枇杷主干韌皮部分離獲得1株內生木霉(Trichodermaatroviride)P3.9，已被證實能成功抑制枇杷根腐病病菌[2]，對枇杷根腐病有良好的盆栽防效，并對枇杷植株無不良影響，此外，它還兼具抗菌譜廣[3]，發酵工藝簡單[4-5]，能成功定殖于枇杷根際[6]及其植株內[7]，能抑制枇杷根際土壤真菌[8]、細菌[9]及枇杷內生真菌[10]等特點，具有重要的開發利用價值。研究已發現，內生木霉P3.9菌株對枇杷植株具有誘導抗性(待發表)，然而，對其誘導枇杷植株產生抗病性的信號轉導途徑尚未明確。

水楊酸(salicylic acid，簡稱SA)和茉莉酸(jasmonic acid，簡稱JA)是與植物防御體系相關的內源信號物質，是誘導植物產生抗病性的重要信號分子[11]。兩者均能啟動植物體內抗病防御基因的表達，從而調控植物抗病反應。水楊酸信號轉導途徑在植物系統獲得性抗病過程中起關鍵作用，病程相關蛋白積累與植物系統獲得性抗性密切相關，水楊酸可以誘導植物體內病程相關蛋白基因的表達[12]，從而增強植物的系統抗性。水楊酸參與植物抗病原真菌[13]、病毒[14]和細菌[15]獲得系統抗性，具有廣譜性。研究發現，煙草花葉病毒(TMV)侵染黃瓜植株后，其體內水楊酸濃度大幅增加，系統獲得性抗性達到最大值[16]。水楊酸合成還與蘋果輪紋病[17]、紫楠炭疽病[18]、葡萄霜霉病[19]、芒果采后病害[20]等抗性有關。茉莉酸信號轉導途徑參與激發植物的誘導系統抗性[21]。研究發現，茉莉酸不同調控通路與香蕉葉斑病[22]、小麥白粉病[23]、稻瘟病[24]、棉花黃萎病[25]、苜蓿黑莖病[26]、油菜菌核病[27]、馬鈴薯晚疫病[28]等植物抗病性有關。茉莉酸合成還與植物叢枝菌根的形成[29]有關。因此，為揭示內生木霉P3.9菌株誘導枇杷植株抗根腐病病菌的信號轉導途徑，本研究從水楊酸和茉莉酸視角，采用高效液相色譜法研究枇杷根系接種木霉生防菌P3.9菌株及枇杷根腐病病菌后，枇杷體內與植物病害防御相關激素含量的變化規律，以期為今后枇杷抗性基因的挖掘及內生木霉P3.9菌劑的系統開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試枇杷及菌株 枇杷苗為大五星品種，由蒙自市十里鋪枇杷育苗基地提供。內生木霉P3.9菌株(T.atroviride)、枇杷根腐病病菌(Pestalotiopsismicrospora)P3.1、P3.5和P3.6菌株保存于紅河學院植物病理學標本室。

1.1.2 供試培養基 PDA培養基：200 g馬鈴薯、17 g葡萄糖、18 g瓊脂、1 000 mL蒸餾水，pH值為7.0。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗時間與地點 于2019年4月9日至6月25日在紅河學院生物科學與農學學院植物病理學實驗室和蘇州科銘生物科技有限公司完成木霉菌劑發酵及激素含量測定；于2019年4月16日前往云南蒙自枇杷育苗基地購買大五星枇杷嫁接苗并移栽至營養袋，置于紅河學院生物科學與農學學院實驗基地。

1.2.2 菌種的擴繁 將木霉P3.9、枇杷根腐病病菌P3.1、P3.5及P3.6菌株接種到PDA培養基上，置于28 ℃培養箱中培養觀察，等到平板上長出孢子后即可取出備用。

1.2.3 木霉菌劑的制備 分別稱量10.0 g米糠、0.2 g果糖、7.0 mL自來水，混勻放入同一個組培瓶，并以同樣的方法準備組培瓶60個。上述稱量好的組培瓶以及250 mL自來水，2個小燒杯(量程為 100 mL)和幾只量程為1、5 mL的注射器采用高壓蒸汽滅菌法，滅完菌冷卻備用。將培養基上的木霉孢子用蒸餾水洗到小燒杯中，稀釋調節孢子濃度為107個/mL，取1 mL接種到上述組培瓶中，置于 28 ℃ 的培養箱中培養5～7 d，視木霉生長情況而定。木霉孢子濃度達106個/g備用。

1.2.4 枇杷苗種植及菌劑接種方法 枇杷嫁接苗種植于營養袋(23 cm×18 cm)中，枇杷基地自然土壤未經消毒，陸地盆栽，苗齡為1年時做接種試驗。用上述木霉菌劑拌土施入根部20 g/株，病原菌菌株用5 mm打孔器打成圓片，用等直徑的打孔器打去枇杷苗根莖韌皮部，將菌片正面貼合木質部接種，保鮮膜纏繞保濕，每株接種3個菌片。處理組1：接種枇杷根腐病病菌P3.1+內生木霉P3.9菌劑，處理組2：接種枇杷根腐病菌P3.5+內生木霉P3.9菌劑，處理組3：接種枇杷根腐病病菌P3.6+內生木霉P3.9菌劑，處理組5：接種內生木霉P3.9菌劑，以施入等量米糠和接PDA圓片為處理組4(對照)，設10次重復，常規肥水管理。接種6 d后分別取對照組和處理組的枇杷根、莖和葉，取3個生物學重復，采用液氮冷凍處理后，在-20 ℃的冰箱中保存，干冰送檢。

1.2.5 激素含量檢測 將上述45個樣品用干冰寄送至蘇州科銘生物科技有限公司，用高效液相色譜法分別檢測茉莉酸、游離水楊酸、結合水楊酸含量。

1.2.6 數據統計 用SPSS 19.0軟件，采用Duncan’s多重比較法處理試驗數據。

2 結果與分析

2.1 木霉P3.9菌株及其與枇杷根腐病病菌互作對枇杷根系JA和SA含量的影響

木霉P3.9菌株及其與枇杷根腐病病菌互作對枇杷根系JA和SA含量的影響情況如表1所示。經Duncan’s多重比較，發現處理組1、2、5 JA含量與對照組4差異極顯著，處理組3與對照組4差異不顯著。處理組1、2、5和對照組4的JA含量分別為 0.239 4、0.211 7、0.483 2、0.331 5 μg/g FW，處理組3的JA含量為0.329 9 μg/g FW。說明木霉P3.9菌株可以促使枇杷根系JA含量增加，其分別與病原菌P3.1、P3.5和P3.6互作，前兩者導致枇杷根系JA含量下降，后者不受影響。處理組1、2、3、5的游離SA含量和對照組4差異極顯著，且均高于對照組4，分別為154.06、128.20、337.67、74.26 ng/g FW。說明木霉P3.9菌株可以促使枇杷根系游離SA含量增加，分別與病原菌P3.1、P3.5和P3.6互作能起到增效作用，其中，與病原菌P3.6互作增效作用最強，與病原菌P3.5互作增效作用最弱，與病原菌P3.1互作增效作用居中。處理組1、2、3、5結合SA含量和對照組4差異極顯著，分別為235.00、1 145.60、780.63、1 236.44 ng/g FW。說明木霉P3.9菌株可以促使枇杷根系結合SA含量增加，其分別與病原菌P3.1、P3.5和P3.6互作增幅消弱，其中，與病原菌P3.5互作降幅最低，與病原菌P3.1互作降幅最高，與病原菌P3.6互作降幅居中。綜上，木霉P3.9菌株通過增加枇杷根系JA和SA含量，提前調度寄主防御系統，抵抗病原菌的攻擊。

表1 木霉P3.9菌株及其與枇杷根腐病病菌互作對枇杷根系JA和SA含量的影響

2.2 木霉P3.9菌株及其與枇杷根腐病病菌互作對枇杷莖部JA和SA含量的影響

木霉P3.9菌株及其與枇杷根腐病病菌互作對枇杷莖部JA和SA含量的影響情況如表2所示。經Duncan’s多重比較，發現處理組1、2、3、5 JA含量和對照組4差異極顯著，且含量明顯增加，分別為0.683 1、1.591 6、1.032 2、1.199 2 μg/g FW。說明木霉P3.9菌株可以促使枇杷莖部JA含量增加，其分別與病原菌P3.1、P3.5和P3.6互作導致JA含量增幅發生變化。其中，與病原菌P3.5互作的增幅大于與病原菌P3.1互作，與病原菌P3.6互作差異不顯著。處理組1、2、3、5 游離SA含量和對照組4差異極顯著，且含量極顯著增加，分別為873.56、273.25、534.23、122.91 ng/g FW。說明木霉P3.9菌株可以促使枇杷莖部游離SA含量增加。其分別與病原菌P3.1、P3.5和P3.6互作能起到協同增效作用，其中，與病原菌P3.1互作增效作用最強，與病原菌P3.5互作增效作用最弱，與病原菌P3.6互作增效作用居中。處理組1、2、3、5結合SA含量與對照組4差異極顯著，且含量增加，分別為614.20、1 272.41、1 535.76、831.28 ng/g FW。說明木霉P3.9菌株可以促進枇杷莖部結合SA含量增加，其分別與病原菌P3.1、P3.5和P3.6互作能起到協同增效作用，其中，與病原菌P3.6互作增幅最大，與病原菌P3.1互作增效作用最弱，與病原菌P3.5互作增效作用居中。綜上，木霉P3.9菌株可以通過增加枇杷莖部JA和SA含量，提前調度寄主防御系統，抵抗病原菌的攻擊。

表2 木霉P3.9菌株及其與枇杷根腐病病菌互作對枇杷莖部JA和SA含量的影響

2.3 木霉P3.9菌株及其與枇杷根腐病病菌互作對枇杷葉部JA和SA含量的影響

木霉P3.9菌株及其與枇杷根腐病病菌互作對枇杷葉部JA和SA含量的影響情況如表3所示。經Duncan’s多重比較，發現處理組1、3 JA含量與對照組4差異極顯著，且含量增加，處理組2、5與對照組4差異不顯著。處理組1、3、4葉部茉莉酸含量分別為0.267 1、0.164 9、0.129 1 μg/g FW，處理組2、5葉部茉莉酸含量分別為0.120 5、0.113 7 μg/g FW。說明木霉P3.9菌株分別與枇杷根腐病菌P3.1、P3.6及P3.5互作，前兩者可以促使葉部JA含量增加，后者不產生影響。處理組1、3、5游離SA含量與對照組4差異極顯著，且含量增加，處理組2與對照組4差異不顯著。處理組1、3、5、4的游離SA含量分別為396.75、508.61、117.16、177.18 ng/g FW，處理組2為184.71 ng/g FW。說明木霉P3.9菌株可以促使枇杷葉部游離SA含量降低，其與病原菌P3.1、P3.6和P3.5互作后游離SA含量變化不一致，前兩者增加，后者不變。處理組1、2、3、5結合SA含量和對照組4差異極顯著，分別為 1 214.31、828.88、2 541.27、1 206.62 ng/g FW。說明木霉P3.9菌株與枇杷根腐病病菌P3.1、P3.6及P3.5互作，結合SA含量變化不一致，前兩者增加，后者降低。綜上，木霉P3.9菌株對枇杷葉部JA和SA含量影響較復雜，其中，游離SA含量降低，結合SA含量升高，JA含量不變。其分別與病原菌P3.1、P3.6和P3.5互作，前兩者JA和SA含量均增加，抵抗病原菌攻擊；后者結合SA含量降低，JA和游離SA含量不變，導致嚴重落葉。

表3 木霉P3.9菌株及其與枇杷根腐病病菌互作對枇杷葉部JA和SA含量的影響

3 討論

木霉P3.9菌株與枇杷互作，枇杷根莖JA、游離SA和結合SA含量均增加。說明木霉P3.9菌株促使枇杷根莖SA和JA含量增加，提前激活枇杷植株防御系統，抵御病原菌的攻擊，對枇杷根莖有誘導抗性作用。此結論與木霉對水稻[30]、黃瓜[31-32]和大豆[33]具有誘導抗性的研究結果一致。據報道，青霉素滅活菌絲體能使煙草SA和JA信號轉導標志基因表達量上調，獲得抗TMV病毒的系統獲得性抗性[34]，木霉P3.9菌株促使枇杷根部過氧化物酶(POD)活性增加(待發表)，由此推測木霉P3.9菌株誘導的枇杷根部SA的積累與POD基因的表達呈正相關。外施SA可以防治冬瓜枯萎病[35]，枇杷根系可通過添加木霉P3.9菌劑誘導SA含量增加，最終達到防治枇杷根腐病的目的，與植物誘抗劑達到異曲同工之效。植物自身具有免疫系統，木霉菌作為植物免疫誘導菌[36]之一，具有重要的開發應用前景。

木霉P3.9菌株與枇杷根腐病病菌互作，枇杷根部游離SA含量增加，莖部JA、游離SA和結合SA含量同時增加。說明枇杷植株被枇杷根腐病病菌攻擊時，木霉P3.9菌株誘導的枇杷根莖部抗根腐病病菌信號轉導通路存在差異，根部主要通過增加游離SA含量來啟動枇杷防御系統，莖部由JA和SA共同啟動其防御系統。SA和JA分別參與活體營養和死體營養病原菌誘導的抗病過程[37]，而枇杷根部主要通過SA信號轉導途徑實現獲得性抗性功能，由此推測枇杷根腐病病菌為活體營養型。木霉P3.9菌株與病原菌P3.5互作，葉部游離SA和JA含量均不受影響。木霉P3.9菌株分別與病原菌P3.1和P3.6互作，葉部游離SA和JA含量均增加，其中，游離SA增幅前者小于后者。葉部結合SA含量與游離SA含量變化一致。木霉P3.9菌株分別與枇杷根腐病病菌P3.1、P3.6和P3.5互作，枇杷根系中游離SA含量增幅不一致，其中，與P3.6互作增幅最大，與P3.5互作增幅最小，與P3.1互作增幅居中。游離SA含量增幅越大致病性越強，說明3株枇杷根腐病病菌致病性存在差異。由此推測枇杷根腐病病菌P3.6菌株的致病性最強，P3.5菌株的致病性最弱，P3.1菌株居中。木霉P3.9菌株分別與枇杷根腐病病菌P3.1和P3.5互作，枇杷根部游離SA含量增加，JA含量降低。此結果可能與JA和SA介導的信號轉導途徑經常發生拮抗[38]有關。木霉P3.9菌株與枇杷根腐病病菌互作，同樣促使枇杷根部POD和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性增加(待發表)，由此推斷以上2種防御酶活性增加與枇杷根部游離SA含量增加相關。此結果與菊花抗白銹病調控機制相似[39]。

SA生物合成途徑及其受體和轉錄因子因不同植物各異[40-41]。WRKY轉錄因子參與調控各種激素信號轉導。然而SA轉導最關鍵的因子是NPR1[37]。JAZ蛋白是JA信號負調控因子，其基因家族成員對病原真菌響應模式各不相同[42]。據文獻報道，木豆中存在激素響應基因家族JAZ[21]，其中，木豆葉片被真菌侵染后，CcJAZ19基因表達量顯著增加。病原真菌侵染誘導植物抗性的分子調控機制研究不斷深入，已明確草莓抗白粉菌[43]、大麥抗赤霉菌[13]等分子調控機制。枇杷抗根腐病病菌分子調控機制也值得我們去深入研究。