羅氏沼蝦Dmc1基因的克隆及表達分析

楊彥豪， 黎 銘， 王 瑞， 黃 姻， 楊慧贊， 黃光華， 邱高峰， 曾 蘭

(1.上海海洋大學/農業農村部淡水水產種質資源重點實驗室/水產科學國家級實驗教學示范中心/上海水產養殖工程技術研究中心，上海 201306；2.廣西壯族自治區水產科學研究院/廣西水產遺傳育種與健康養殖重點實驗室，廣西南寧 530021)

Dmc1(disrupted meiotic cDNA)基因是DNA重組酶RecA/Rad51家族成員之一，在同源染色體配對、聯會、重組和分離過程中具有重要作用[1]。Dmc1基因最早在酵母中發現，被鑒定為減數分裂過程中的特異性基因[2]，具有催化DNA雙鏈交換的能力[3]，還可以通過抑制解旋酶Srs2的活性來協助減數分裂過程中交叉的形成，從而保證減數分裂的完整性[4]。已有的研究表明，在減數分裂過程中，Dmc1基因可在睪丸和卵巢特異表達，其突變可能導致減數分裂停滯[5-7]。迄今為止，已在多個物種中發現Dmc1基因，一些水生動物的Dmc1基因也得到了克隆和鑒定[11-16]。

羅氏沼蝦(Macrobrachiumrosenbergii)是淡水養殖蝦類主要品種之一。近年來，由于引種混亂、育苗技術不規范、近親繁殖等，造成羅氏沼蝦種質資源退化問題日趨嚴重，影響了羅氏沼蝦產業的可持續發展。隨著分子生物學技術的快速發展，探索研究羅氏沼蝦生長發育相關的分子調控機制成為解決這些問題的可行途徑。目前，有關羅氏沼蝦的研究主要集中在生物形態學[17-18]、種群生態學[19-20]、遺傳學[21-24]方面，有關羅氏沼蝦Dmc1基因的研究尚未見報道。本研究利用RACE技術對羅氏沼蝦Dmc1(MrDmc1)基因進行全長cDNA克隆，利用生物信息學方法分析MrDmc1基因編碼區特征、理化性質及系統進化關系，并利用熒光定量PCR對其在不同組織、卵巢發育不同時期的表達情況進行分析，以期為進一步研究MrDmc1基因在卵巢發育過程中的作用，探究羅氏沼蝦卵巢發育分子調控機制，建立羅氏沼蝦卵巢發育人工調控新技術，推進羅氏沼蝦遺傳改良及分子輔助育種奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料來自廣西南寧國家級羅氏沼蝦良種場，選擇健康的4月齡羅氏沼蝦，采集卵巢置于液氮中速凍，-80 ℃冰箱中保存備用，用于Dmc1基因克隆。

1.2 引物設計與合成

根據GenBank中斑節對蝦Dmc1基因序列(EU440762)，利用Primer 5.0軟件設計接頭引物、5′RACE特異性引物、3′RACE特異性引物和實時熒光定量PCR引物，引物序列見表1。引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物信息

1.3 羅氏沼蝦總RNA提取及cDNA合成

凍存的卵巢組織按Trizol提取試劑盒說明書的步驟提取總RNA，經1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA。去除基因組DNA后，進行cDNA第1鏈合成，合成cDNA置于-20 ℃保存備用。

1.4 MrDmc1基因克隆

1.4.1 5′-RACE 以特異性引物RC779-RT1/RC779-RT2反轉錄，得到cDNA，經RNase H 和末端轉移酶TdT處理后，進行巢氏PCR(操作步驟見英杰公司5′-RACE系統手冊)。PCR反應條件見表2。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測回收純化后連接pMD18-T載體，轉化感受態細胞(SK2301)，以pMD18-T載體的通用引物做菌落PCR，將PCR產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

1.4.2 3′-RACE 以3′接頭引物做反轉錄，獲得的cDNA為模版進行巢式PCR，PCR反應條件見表3。PCR產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，經過膠回收、純化后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。根據5′RACE和3′RACE測序得到的序列，利用DNAMAN軟件拼接獲得MrDmc1基因的全長序列。

表2 5′-RACE反應條件

表3 3′-RACE反應條件

1.5 生物信息學分析

通過NCBI ORF finder(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)網站在線分析基因的開放閱讀框(ORF)和其編碼的氨基酸序列；MrDMC1蛋白的保守結構域由NCBI conserved domain(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)和Pfam(http：//pfam.xfam.org/)在線預測獲得；利用 Expasy ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)分析MrDMC1蛋白質氨基酸組成、分子量、理論等電點等；利用RARE CODON CALTOR在線軟件(http：//https：//people.mbi.ucla.edu/sumchan/caltor.html)計算基因序列的稀有密碼子；利用ProtScale、SignalP 6.0 Sever和TMHMM Sever v.2.0在線分析蛋白質的親疏水性、信號肽。利用NetNGlyc 1.0 server和NetPhos 3.1 server預測蛋白糖基化和磷酸化位點；利用PSORTⅡ Prediction 在線軟件(http：//psort.hgc.jp/form2.html)進行亞細胞定位；通過SOPMA和SWISS-MODEL在線預測工具分析MrDMC1蛋白的二級和三級結構；用DNAStar軟件中的MegAlign程序對MrDmc1基因序列與其他物種的Dmc1基因序列進行比對，并利用MEGA 5.1軟件中鄰接法(Neighbor Joining)構建系統進化樹。

1.6 實時熒光定量PCR分析MrDmc1基因的表達

根據克隆獲得的MrDmc1基因序列設計引物，以β-action基因作為內參，進行實時熒光定量PCR反應。反應體系如下：Premix ExTaqTMⅡ 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 5 μL，ddH2O 4μL；擴增程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性15 s，60 ℃延伸30 s，40個循環。利用2-ΔΔCT法計算MrDmc1基因的相對表達量。利用IBM SPSS Statistics軟件對MrDmc1基因表達差異性進行單因素方差分析，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 羅氏沼蝦總RNA提取及檢測

使用Trizol法提取羅氏沼蝦卵巢的總RNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，NanoDrop 2000分光光度計檢測其純度和濃度，選取D260 nm/D280 nm的值在1.90～2.0范圍的樣品用于后面的試驗研究(圖1-A)。

2.2 MrDmc1基因全長序列克隆及序列分析

利用特異性引物RC779-RT1/RC779-RT2反轉錄，得到cDNA，經RNase H 和TdT處理后，進行5′-RACE巢氏PCR(圖1-B)；利用3′接頭為反轉引物的cDNA為模版進行3′-RACE巢式PCR(圖1-C)；通過DNAMAN拼接獲得MrDmc1基因全長序列，對基因序列分析表明MrDmc1基因序列全長為 1 627 bp，ORF為1 026 bp，包含542個密碼子，編碼蛋白包含341個氨基酸(圖2)。

2.3 生物信息學分析

對MrDmc1基因進行生物信息學分析，結果表明，MrDMC1蛋白分子式為C1648H2644N460O514S10，理論分子量為37.4 ku，為親水性穩定蛋白(圖3)；該蛋白具有Rad51結構域和helix-hairpin-helix(HhH)結構域(圖4)，沒有跨膜區域和信號肽切割位點(圖5)，含有1個N-糖基化位點和25個磷酸化位點(圖6)；該蛋白主要存在于細胞質(60.9%)、細胞核(17.4%)和細胞骨架中(17.4%)；該蛋白二級結構中α-螺旋、延伸鏈、β-轉角、無規卷曲分別占48.39%、13.78%、7.04%、30.79%，三級結構與人減數分裂重組蛋白DMC1(SWTL ID：7c99.1)的相似度為78.11%(圖7)。

2.4 系統進化樹

在NCBI數據庫中下載凡納濱對蝦(Penaeus vannamei，ADM45305.1)等31個物種DMC1蛋白的氨基酸序列，利用MEGA 5.1軟件構建系統進化樹(圖8)，結果表明羅氏沼蝦與甲殼綱動物的進化關系最為接近，與魚類的親緣關系較遠。

2.5 MrDmc1基因的mRNA表達分析

MrDmc1基因的組織表達譜表明，在雌蝦7個不同組織中MrDmc1基因均有表達，其中，在心臟中的表達量最高，其次是肝胰腺、鰓，在眼中的表達量最低。單因素方差分析發現，除在卵巢與肌肉、肝胰腺與鰓中的表達量差異為不顯著外，其他各組織之間的表達量差異均為極顯著(P<0.01)(圖9)。

以4個不同發育時期的羅氏沼蝦卵巢組織為試驗材料，進一步研究MrDmc1基因在卵巢中的表達規律，結果表明，在卵巢發育過程中，MrDmc1基因呈先上升再下降的趨勢，在卵巢發育Ⅱ期表達量達到最高，從卵巢發育Ⅱ期開始表達量逐步降低。單因素方差分析表明，MrDmc1基因在不同發育時期卵巢中的表達差異為極顯著(P<0.01)(圖10、圖11)。

3 討論

利用現代分子生物學技術，探究羅氏沼蝦生長發育相關的分子調控機制，是推動羅氏沼蝦產業可持續發展的重要途徑。因此，深入開展羅氏沼蝦生殖發育相關的分子研究，揭示羅氏沼蝦卵巢發育的分子調控機制尤為關鍵。Dmc1基因已被證明是具有DNA重組酶活性的RecA/Rad51超家族的成員之一[25]。對同源染色體之間DNA鏈的交換和減數分裂過程中斷鏈雙鍵的修復是必不可少的[26]。本研究利用RACE技術對羅氏沼蝦Dmc1基因進行克隆，獲得了MrDmc1基因的全長cDNA序列，為MrDmc1基因功能等方面研究奠定基礎。

一些水生動物Dmc1基因已有報道，且不同動物的Dmc1基因長度不同[11-17]。本研究首次克隆了羅氏沼蝦MrDmc1基因的核苷酸序列，并對其進行了生物信息學分析，發現該基因全長為1 627 bp，ORF為1 026 bp，編碼341個氨基酸，與斑節對蝦、中華絨螯蟹、 克氏原螯蝦的基因編碼區一致。基因相似性分析表明，羅氏沼蝦MrDmc1與中華絨螯蟹、克氏原螯蝦、凡納濱對蝦和美洲龍蝦的基因相似性較高；氨基酸序列同源性比較表明，羅氏沼蝦MrDMC1與克氏原螯蝦同源性最高，為92.96%，其次是美洲龍蝦(90.91%)和凡納濱對蝦(90.32%)，與文昌魚同源性最低，為77.35%；系統進化樹表明，羅氏沼蝦MrDmc1基因與克氏原螯蝦、凡納濱對蝦等甲殼類動物進化關系較近，與魚類的親緣關系較遠，說明該基因在不同物種間的保守型存在差異。生物信息學分析表明，羅氏沼蝦MrDMC1蛋白的分子量為37.4 ku，為穩定親水性蛋白，該蛋白中無信號肽和跨膜區域，不是跨膜蛋白或分泌蛋白，MrDMC1蛋白存在1個N-糖基化位點和25個磷酸化位點，主要定位于細胞質中。預測結果可為后期體外構建羅氏沼蝦MrDmc1基因原核表達載體及蛋白的表達優化提供重要的科學數據。

組織表達分析顯示，MrDmc1基因在羅氏沼蝦卵巢等7個組織中均有表達，且在不同組織中存在差異，在心臟中的表達量最高，其次是肝胰腺、鰓，在眼中的表達量最低。已有的研究表明，Dmc1基因在多個物種的性腺中高表達，在不同倍性鯉魚[12]、紅腹蠑螈[27]、達氏鱘[28]和南方鲇[29]的研究中，Dmc1基因只在性腺中表達。在斑節對蝦的研究中，Dmc1基因在性腺、心臟和血細胞中均有表達[14]；在日本鰻鱺的研究表明Dmc1基因主要在性腺中表達，在大腦中也有表達[11]。在本研究中，MrDmc1基因在卵巢中的表達水平不高，與所用卵巢樣品處于的卵巢發育Ⅲ期有關；MrDmc1基因在卵巢等7個不同組織中均有表達，表明Dmc1基因在脊椎動物和無脊椎動物中的生物功能可能存在差別。

MrDmc1基因在不同發育時期卵巢中的表達結果顯示，MrDmc1基因在卵巢發育Ⅰ期到Ⅱ期表達量逐步增高，在卵巢發育Ⅱ期達到最高，從卵巢發育Ⅱ期開始MrDmc1基因表達量逐步降低。達氏鱘Dmc1基因在0～Ⅰ期精巢中不表達，在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期精巢中表達量逐步升高，并在Ⅳ期精巢中達到最高，在Ⅴ期精巢中，表達量顯著下降[29]；小鼠dmc1基因僅在減數分裂Ⅰ細線期到偶線期的精母細胞中特異表達[10]；蠑螈dmc1基因在減數分裂Ⅰ細線期開始表達，一直持續到精子生成階段[27]。日本鰻鱺dmc1基因只在減數分裂Ⅰ的早期表達，并且持續到粗線期，但是表達量卻逐漸降低[11]。本研究發現MrDmc1基因在卵巢發育早期表達量較高，隨著卵巢的逐漸成熟，MrDmc1隨之降低，在卵巢發育Ⅱ期表達量最高，隨后逐漸降低，說明MrDmc1基因參與了羅氏沼蝦卵巢發育，推測其在卵巢發育早期發揮關鍵的調控作用。

4 結論

本試驗通過RACE技術獲得羅氏沼蝦MrDmc1基因，基因全長為1 627 bp，ORF為1 026 bp，存在542個密碼子，編碼341個氨基酸；系統進化樹發現羅氏沼蝦MrDmc1基因與克氏原螯蝦、凡納濱對蝦等甲殼類動物進化關系較近。生物信息學分析表明，MrDMC1蛋白分子量為37.4 ku，沒有跨膜區域和信號肽切割位點，含有1個N-糖基化位點和25個磷酸化位點，是親水性蛋白，主要存在細胞質中。熒光定量PCR檢測結果顯示，MrDmc1基因在卵巢等7個組織中均有表達，且在不同組織中存在差異；MrDmc1基因在卵巢發育Ⅱ期表達量達到最高，推測其在卵巢發育早期發揮關鍵的調控作用。試驗結果可為進一步研究羅氏沼蝦Dmc1基因的生物學功能，探究羅氏沼蝦卵巢發育分子調控機制提供重要依據。