干燥方式對蛋清蛋白理化性質和功能特性的影響

孫樂常，曾 添，林端權，翁 凌，劉光明，繆 松,3,4，曹敏杰,

（1.集美大學海洋食品與生物工程學院，福建廈門 361021；2.海洋食品精深加工關鍵技術省部共建協同創新中心，大連工業大學，遼寧大連 116034；3.水產品深加工技術國家地方聯合工程研究中心，福建廈門 361021；4.愛爾蘭農業部農業與食品發展局Teagasc食品研究中心，芒斯特科克 999014）

雞蛋是人類日常飲食中最常見且不受宗教和種族影響的食物之一，同時也是人們日常飲食中價格低廉但營養價值極高的食物。蛋清蛋白具有良好的凝膠性、起泡性和乳化性等多種功能特性，常被用作添加劑廣泛應用于食品加工領域[1]。目前，蛋清蛋白主要以粉狀與液態形式進行商品化銷售。相較于蛋清液，蛋清蛋白粉具有運輸方便、貨架期長、均一性高和微生物安全等特點，具有更大的市場應用價值[1]。

目前，工業上蛋清粉的制備方法以噴霧干燥和真空冷凍干燥為主，并輔以一定的前處理或改性。噴霧干燥生產效率高且成本較低，但熱處理會導致敏感的蛋清成分，如卵類粘蛋白[2]等變性，從而可能影響蛋清蛋白整體的功能特性。Katekhong等[3]與代曉凝等[4]研究發現采用噴霧干燥的高溫會使蛋清蛋白的構象部分展開，暴露的巰基增加，有助于蛋白質的聚集，從而有利于蛋清粉的凝膠性。另一方面，冉樂童等[5]將蛋清液巴氏殺菌后進行噴霧和冷凍干燥，發現冷凍干燥蛋清粉的起泡性、起泡穩定性和乳化性優于噴霧干燥，但熱穩定性較噴霧干燥低。Kudre等[6]將蛋清蛋白進行磷酸化預處理后再進行干燥，則發現冷凍干燥磷酸化蛋清蛋白具有更高的乳化性、持油力與凝膠性，而起泡性能力則低于噴霧干燥[7]。由此可見，蛋清蛋白的冷凍干燥與噴霧干燥相比各具優勢，且一定的前處理會對干燥蛋清蛋白的性質產生顯著影響[5,8]。系統揭示干燥過程中蛋白的理化性質及其功能特性的變化規律對蛋清蛋白在不同食品生產加工中的科學應用具有重要意義。目前，國內外對干燥蛋清蛋白的研究大多圍繞干燥的條件[9-11]或一定的改性處理[1,6]對凝膠性及其儲藏穩定性[7,12-13]等方面，而對天然蛋清蛋白的直接干燥及其理化性質與功能特性的變化機理卻缺乏系統性研究。

基于此，本文以雞蛋清蛋白為對象，通過測定內源性熒光、表面疏水性、游離巰基含量、二級結構組成、溶解度、接觸角以及表面張力等指標，表征蛋清蛋白經過噴霧干燥或真空冷凍干燥處理后的構象變化，同時分析蛋清蛋白的乳化性和起泡能力等功能特性，以探究不同干燥方式對蛋清蛋白功能特性的影響機理，旨在為蛋清粉在食品加工領域中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞蛋、玉米油 福建省廈門市集美區大潤發超市，雞蛋放置于4 ℃冰箱中備用，玉米油放置于室溫陰涼處；苯胺基-1-萘磺酸銨鹽（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid ammonium salt，ANS） 美國Sigma公司；標準蛋白 美國Thermal公司；十二烷基硫酸鈉（SDS，電泳純）和丙烯酰胺 Bio-Rad公司；三羥甲基氨基甲烷（Tris）、氫氧化鈉、鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉等其他試劑 均為國產分析純。

WSC-S色差計 中國上海儀電物理光學儀器有限公司；G:BOX凝膠成像儀 英國Syngene公司；BZY-1全自動表面張力儀 中國上海Sunny衡平科學儀器有限公司；CA-100接觸角測量儀 上海盈諾精密儀器有限公司；Avanti JA-10高速冷凍離心機、pH計 美國Beckman公司；Vector-22傅里葉變換紅外光譜儀 瑞士Bruker公司；FP-8200熒光分光光度計 日本Jasco公司；TCS SP8激光掃描共聚焦顯微鏡 德國Leica公司；Alpha 1-4 LDplus冷凍干燥機 德國Christ公司；Echo Revolve 熒光倒置顯微鏡 美國Tousimis公司；DHR-2流變儀 美國TA儀器公司；Phenom Pro掃描電子顯微鏡 荷蘭Phenom-World Pr公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋清液的制備及干燥 參照Chang等[14]的方法并做適當修改。將蛋清和蛋黃分離，取蛋清用1 mol/L HCl調pH至6.0，攪拌15 min后再次調pH至6.0，于4 ℃攪拌30 min，8000 g離心10 min后除去不溶性蛋白，取上清液得到蛋清液（EWP-C）存放于4 ℃冷庫中備用，分別按下述條件制備相應的干燥蛋白粉。

干熱噴霧干燥蛋清粉（EWP-P）：進風溫度170 ℃，出風溫度 70 ℃；蠕動泵12 r/min。

真空冷凍干燥蛋清粉（EWP-D）：-70 ℃預凍過夜；真空度0.63 Pa，冷凍干燥溫度-48 ℃、時間2 d；溶液厚度5～8 mm。

1.2.2 SDS-PAGE分析 將蛋清液和蛋清粉溶液的蛋白濃度調整為10 mg/mL。添加約7%的β-巰基乙醇作還原處理進行對比。分離膠的濃度為12%，濃縮膠的濃度為5%，蛋白上樣量為40 mg，電流為12 mA。電泳結束后，將膠取出用考馬斯亮藍染色液在室溫下染色1 h，然后用脫色液脫色，最后利用凝膠成像儀分析蛋白質條帶。

1.2.3 白度的測量 用色差儀直接測定蛋清粉的亮度值（L*）、紅（a*）、黃（b*）。測定5次取平均值。L*為正值表示偏亮，反之偏暗；a*為正值偏紅，反之偏綠；b*為正值偏黃，反之偏藍。白度的計算公式如下：

式中：L*、a*、b*值分別為經不同干燥處理蛋清粉的亮度、紅度和黃度。

1.2.4 內源性熒光測定 參考Yu等[15]的方法測定了各樣品的內源性熒光強度。將EWP樣品稀釋至0.1 mg/mL。采用熒光分光光度計記錄激發波長為258、275和295 nm的時的熒光光譜，發射光譜范圍為300～500 nm，狹縫寬度為5 nm。

1.2.5 表面疏水性測定 根據熒光探針劑ANS法測定樣品的表面疏水性。將樣品稀釋至0.025～0.1 mg/mL，取2 mL樣品與8 μL ANS（20 mmol/L）混勻，渦旋振蕩3 s，避光20 min測定熒光強度，測試所用的激發波長為390和470 nm，狹縫寬度為10 nm。

1.2.6 總游離巰基和表面游離巰基測定 用Ellman's法[16]分析了蛋清液和不同干燥方式蛋清粉之間蛋白質中總游離巰基和表面游離巰基的區別，摩爾消光系數為13600 M-1cm-1。

1.2.7 傅里葉變換紅外光譜（Fourier Transform Infrared Spectroscopy，FTIR）分析 用瑪瑙研缽將蛋清粉樣品磨細，將樣品與溴化鉀混合，壓成片狀后測量。25 ℃下，在4000～500 cm-1的波數范圍內對每個樣品進行分析。每個樣品以空氣為背景、KBr為空白對照進行掃描。每次測量都是32次掃描的疊加。用Omnic軟件基線校正和傅里葉自取卷積后使用PeakFit軟件對1600～1700 cm-1區域進行歸一化。利用高斯峰和曲線擬合模型對二級結構組分進行定量估計。

1.2.8 溶解度測定 參照Latorres等[17]的方法測定蛋清粉的溶解度并做適當修改。稱取0.2 g蛋清粉溶解于20 mL DDW，用1 mol/L HCl 或1 mol/L NaOH將溶液的pH調節至2.0，4.0，6.0，8.0和10.0，混合溶液在30 ℃下以100 r/min的轉速攪拌30 min，然后7500×g，離心10 min，取上清，用Lowry法測定上清液蛋白質含量。全蛋白含量用蛋白溶解液（20 mmol/L PBS，2% SDS，8 mol/L Urea，pH8.0）充分溶解蛋白樣品后的蛋白含量表示。

1.2.9 接觸角測定 接觸角是三相（液、固、氣）接觸點的切角，是測定粉體潤濕性的常用參數。由于潤濕行為是一個動態過程，因此可以通過監測接觸角的變化率來量化潤濕過程。參照Li等[18]的方法，用接觸角測量儀測量粉體的水接觸角變化。設置的參數為5 μL水滴體積和介質滴定速率。記錄0～60 s的接觸角。每個樣品的測量至少重復5次。

1.2.10 表面張力測定 采用全自動表面張力儀，以及鉑金板法測定不同pH下濃度為1%（w/v）的蛋清溶液表面張力。

1.2.11 乳化性和乳化穩定性測定 蛋清蛋白的乳化活性指數（emulsifying ability index，EAI）和乳化穩定性（emulsifying stability index，ESI）參考Dabbour等[19]的方法并作適當修改。制備不同pH（2.0、4.0、6.0、8.0、10.0）含1%（w/v）蛋清蛋白的溶液，取15 mL溶液與5 mL玉米油混合，在10000 r/min條件下高速均質1 min。分別在0、30 min時從離心管底部取50 μL溶液，加入到4950 μL 0.1% SDS溶液中，渦旋5 s混勻，立即在500 nm波長處測定吸光度。

式中：T為濁度（2.303）；A0為0 min時吸光度；DF為稀釋倍數（100）；ρ為蛋白質濃度（g/mL）；φ為油相與水相的比例（0.25）；Δt為時間差/min；At為放置30 min后吸光度。

1.2.12 起泡性和泡沫穩定性 參考Dabbour等[19]的方法測定蛋清蛋白的起泡性（foaming capacity，FC）和泡沫穩定性（foaming stability，FS），將蛋清蛋白溶液稀釋至1%（w/v），調節pH至2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，用高速分散器以10000 r/min的速度均質1 min，記錄均質前后體積。將樣品靜置30 min后，再次記錄樣品體積。

式中：V1為均質前體積（mL）；V2為均質后體積（mL）；V3為均質30 min后體積（mL）。

1.2.13 乳液的微觀結構分析

1.2.13.1 乳液的制備 蛋清蛋白乳液的制備參考Xu等[20]的方法并略作修改。90 mL含1%（w/v）蛋清蛋白溶液的超純水作為乳液的水相，10 mL玉米油為油相，10000 r/min條件下高速均質2 min，分別50 MPa高壓均質0、1、2次（分別用EWP-P0、EWPP1、EWP-P2和EWP-D0、EWP-D1、EWP-D2表示）。加入0.02% NaN3作為防腐劑，抑制細菌增長。

1.2.13.2 熒光倒置顯微鏡 用熒光倒置顯微鏡觀察蛋清液及不同干燥方式蛋清粉均質不同次數后乳液的微觀結構。取20 μL乳液置于載玻片上，并用蓋玻片小心的蓋住。平衡2 min后，拍攝放大率為400倍下的蛋清蛋白乳液的微觀結構照片。

1.2.13.3 激光掃描共聚焦顯微鏡 參考Xu等[20]的方法并作適當修改。將樣品用0.1%（w/v）的尼羅紅和FITC試劑染色，并在黑暗中孵育10 min。在室溫下避光環境中由Leica TCS SP8系統在激發波長為488 nm下（放大倍數為400倍）進行分析。

1.3 數據處理

所有的試驗均至少重復三次取平均值加減標準差，利用IBM SPSS Statistics 21軟件和Duncan多重檢驗方法對實驗數據進行方差分析和顯著性分析，并采用Origin 9.0軟件處理實驗數據及畫圖。

2 結果與分析

2.1 不同干燥方式蛋清蛋白的SDS-PAGE分析

如圖1所示，蛋清中主要含有三種蛋白：卵清蛋白（45 kDa）、卵轉鐵蛋白（76 kDa）和卵粘蛋白。卵粘蛋白主要有α-和β-兩個亞基，α-卵粘蛋白又分為兩種類型：α1-和α2-，分子量分別為150和220 kDa；β-卵粘蛋白的分子量為400～720 kDa[21]。非還原條件下SDS-PAGE上方出現許多高聚物條帶，添加β-巰基乙醇后，高聚物條帶消失，表明該高聚物由蛋白通過二硫鍵聚合而成。蛋清蛋白中原有的卵類粘蛋白與溶菌酶在本實驗室并未被檢測到，可能是由于卵類粘蛋白在蛋清前處理將稀釋、調節pH和攪拌時會發生絮凝，形成白色絮狀物，從而被離心除去[2,22]。溶菌酶的不可逆變性臨界點是77 ℃，因此噴霧干燥（溫度高達180 ℃）過程中溶菌酶可能會變性從而造成損失[23]。此外，冷凍干燥也會造成溶菌酶的損失，如Kudre等[6]在比較日本鵪鶉（Coturnix japonica）和白來航雞（White Leghorn）冷凍干燥蛋清粉的SDS-PAGE時也發現了冷凍干燥過程中溶菌酶損失的現象。蛋清蛋白各組分在還原條件（圖1A）下的分子量略大于非還原條件（圖1B），這是因為SDS與蛋白質結合會引起蛋白質構象改變，使蛋白質形成一種長橢圓棒狀結構，加入足夠量的SDS和β-巰基乙醇可使蛋白質的遷移速率僅與蛋白質分子大小有關[24-25]。未加入β-巰基乙醇（非還原狀態）時蛋白質遷移速度更快可能是因為蛋白質中的二硫鍵未打開，蛋白質與SDS結合形成長橢圓棒狀物的長軸較短，遷移速度更快，因此蛋白質條帶的分子量較小。EWP-C、EWP-P和EWP-D蛋白條帶幾乎沒有區別，表明本實驗的干燥條件未對蛋清蛋白組分造成明顯影響。

圖1 蛋清液和不同干燥方式蛋清粉蛋白質模式圖Fig.1 Protein pattern of egg white proteins by different drying methods

2.2 不同干燥方式蛋清蛋白的外觀和色澤分析

如圖2所示，EWP-P為細膩的鵝黃色顆粒粉末，EWP-D為松散的黃色片狀物。EWP-P的L*、a*和b*值分別為53.90±0.23、-2.06±0.70和6.04±0.21。EWP-D的L*、a*和b*值分別為49.89±0.36、-1.65±0.26和3.84±0.50（表1）。EWP-P的b*值較大是因為蛋清蛋白中的葡萄糖在噴霧干燥過程中與蛋白發生了美拉德反應[3]。此外，真空冷凍干燥需將樣品進行冷凍預處理，冷凍過程中，蛋清蛋白會發生褐變反應，故EWP-D最終呈現出的顏色較EWP-P黃（圖2）。EWP-P的顏色較EWP-D白（圖2），可能是因為干熱噴霧干燥的干燥速度快，蛋清中的蛋白質受熱時間短。因此在本實驗干燥條件下，干熱噴霧干燥所得的蛋清蛋白粉更亮、更白，易被消費者接受。

圖2 不同干燥方式EWP的宏觀圖Fig.2 Macrograph of EWP for different drying methods

表1 干熱噴霧干燥蛋清粉和真空冷凍干燥蛋清粉的色差Table 1 Color difference of dry heat spray drying and vacuum freeze-drying egg white powder

2.3 不同干燥方式蛋清蛋白的內源性熒光分析

蛋白質的固有熒光來自于內部的芳香族氨基殘基（酪氨酸 Tyr、色氨酸 Trp、苯丙氨酸 Phe），其熒光最大值（λmax）、強度對其微環境的極性極其敏感，因此可用來表征蛋白質的三級結構變化，其中Trp、Tyr和Phe的特有熒光激發波長分別為295、275和258 nm[15]。如圖3所示，與EWP-C相比，不同干燥方式制備的蛋清粉的固有熒光強度降低但熒光峰的位置未有明顯的遷移。EWP-P的熒光強度低于EWP-D于EWP-C，可能是因為噴霧干燥的干燥溫度高，蛋清蛋白變性程度大，芳香族氨基酸殘基暴露于更極性環境中，進而發生了熒光猝滅現象。此外，EWP-P的熒光強度較低還可能是由于蛋清蛋白中含有葡萄糖，在高溫下會與蛋白質發生美拉德反應，屏蔽了芳香族氨基殘基[4]。

圖3 蛋清液及不同干燥方式EWP的內源性熒光Fig.3 Endogenous fluorescence of EWP in egg white liquid and different drying methods

2.4 游離巰基和表面疏水性分析

總游離巰基包含蛋白質分子內部和表面的游離巰基。巰基的變化會影響蛋白質的結構和功能，如溶解度、乳化性和膠凝性能等[26]。如圖4所示，EWPC、EWP-P和EWP-D的總游離巰基分別是103.81±2.10、93.40±5.93和113.61±7.63 μmol/L，其游離巰基分別是41.96±8.31、56.18±2.88和45.39±1.97。與EWP-C相比，EWP-P表面游離巰基含量顯著升高（P＜0.05）、總游離巰基含量顯著降低（P＜0.05）。而EWP-D與EWP-C相比總巰基和表面游離巰基含量差異不顯著（P＞0.05）。這可能與噴霧干燥過程中卵清蛋白的變性有關，天然狀態的卵清蛋白中含有埋藏于球狀分子內部的游離巰基，而高溫破壞了卵清蛋白的空間結構使內部巰基暴露在蛋白表面[27]。三種蛋清蛋白的表面疏水性與表面游離巰基含量變化趨勢一致， EWP-C和EWP-D的表面疏水性差異不顯著（P＞0.05），但其表面疏水性顯著低于EWP-P組（P＜0.05），這可能也與噴霧干燥的高溫環境有關，該環境下蛋清蛋白部分展開，導致內部疏水基團暴露，從而表面疏水性增高。代曉凝等[4]將自然發酵后的蛋清液分別進行冷凍、熱風和噴霧干燥處理，比較三種蛋清粉與溴酚藍的結合率從而判斷其表面疏水性大小為：冷凍干燥＞噴霧干燥＞熱風干燥，推測是噴霧干燥發生美拉德反應引入親屬基團所致。這與本文研究不一致，可能是因為蛋清前處理不同，自然發酵時微生物可能會改變蛋清蛋白的結構。

圖4 不同干燥方式蛋清粉的總游離巰基（TSH）、表面游離巰基（SH）和表面疏水性（H0）Fig.4 Total free sulfhydryl group (TSH), surface free sulfhydryl group (SH) and surface hydrophobicity (H0) of egg white powder by different drying methods

2.5 傅里葉變換紅外光譜分析

不同干燥方式蛋清蛋白的紅外光譜如圖5所示。EWP-P和EWP-D在酰胺A帶（3700～3200 cm-1）處有強吸收峰，EWP-P的峰強大于EWP-D，表明干燥方式會影響蛋清蛋白的水合能力，這可能與蛋白質分子中N-H鍵舒展并與氫鍵形成了締合體，或蛋白質分子與葡萄糖以共價鍵結合有關[4]。酰胺B帶（2961.64 cm-1）的弱吸收峰主要由C-N鍵產生。酰胺I帶 （1600～1700 cm-1）信號主要由C-O鍵伸縮振動引起，與蛋白質的二級結構有關，涉及β-折疊（1600～1640 cm-1）、無規則卷曲（1640～1650 cm-1）、α-螺旋（1650～1660 cm-1）和β-轉角（1660～1700 cm-1）[28]。采用Peak fit軟件對不同干燥方式蛋清蛋白的酰胺I帶峰強進行高斯曲線擬合分析，根據峰面積計算其二級結構的相對百分含量，結果如表2。EWP-P和EWP-D的二級結構以β-折疊和β-轉角為主，EWPP的β-折疊含量增加主要與卵轉鐵蛋白熱變性有關[29]，同時分子間的β-折疊結構也易轉變為β-轉角

表2 不同干燥方式蛋清粉的二級結構含量Table 2 Secondary structure content of egg white powder by different drying methods

圖5 不同干燥方式蛋清蛋白傅里葉變換紅外光譜圖Fig.5 FTIR of egg white proteins in different drying modes

結構[29]。而α-螺旋下降可能是因為熱變性導致α-螺旋中的氫鍵斷裂，進而發生了解螺旋現象[30]。EWPP無規則卷曲增加，表明其部分有序結構向無規則卷曲轉化，蛋白變性明顯，結構的隨機性增強。

2.6 不同干燥方式蛋清蛋白的溶解度分析

溶解性是蛋白重要的功能特性之一，與接觸角、表面張力、乳化性等密切相關。如圖6A，不同pH下不同干燥方式的蛋清粉溶解度的測量。EWP-P的溶解度隨著pH的升高先減小后增大，這可能是因為在酸性和堿性環境中球狀蛋白質會發生部分展開，形成熔融球狀構象，變得更加靈活，更容易與水分子作用[31]。pH為6.0時蛋清蛋白的溶解度最低，可能是因為該pH與蛋清蛋白中大部分蛋白的等電點相近，蛋白帶電荷量較少，因此容易發生沉淀。與EWPP相比，EWP-D在pH6.0時溶解度的下降程度較小，這可能與真空冷凍干燥后蛋清蛋白的微觀結構呈片狀，具有較大的比表面積有關，也可能是因為冷凍干燥蛋白質在脫水過程中蛋白質變性低，促進了可溶性聚集物生成[5,19]。EWP-D的溶解度遠大于EWP-P，這是因為噴霧干燥是直接將蛋清液霧化后再干燥，其蛋清粉表面會形成一個光滑、抗濕性的薄膜，最終導致蛋白的溶解性降低，復水性差且易結塊[32]。而真空冷凍干燥經過冷凍升華，可保持食品原有的形狀故具有很好的速溶性和復水性[33]。Shaviklo等[34]也發現噴霧干燥的含添加劑（花粉）蛋白的蛋白質溶解度明顯低于凍干蛋白。

圖6 不同干燥方式蛋清粉的功能性質Fig.6 Functional properties of egg white powder by different drying methods

2.7 不同干燥方式蛋清蛋白的接觸角分析

接觸角值作為時間函數的變化，表征了潤濕行為，是評價粉體潤濕性的常用指標。當樣品的接觸角大于90°時，表明其疏水性較強，反之則親水性較強[35]。不同干燥方式制備的蛋清蛋白粉與水相的接觸角如圖6B所示，EWP-P在0 s時的接觸角為99.62°，表現出疏水性特征；EWP-D的接觸角為65.97°，表明其具有較好的親水性。樣品與水滴接觸60 s后，由于水進入到了粉末內部，兩種樣品的接觸角不斷減小，EWP-P的接觸角下降到97.07°，EWPD的接觸角下降到59.59°，EWP-D在60 s內接觸角的下降速率更大，表明其具有更好的潤濕性，這可能與干燥后粉末的微觀結構有關。冉樂童等[5]利用掃描電鏡觀察了冷凍干燥與噴霧干燥蛋清蛋白粉的微觀結構，發現EWP-P粉末是球狀帶孔的結構，且粒徑較小，而EWP-D則呈現出較大、松散的片狀結構。相較于EWP-P的球狀結構，EWP-D的松散片狀結構可能更有利于水分在其內部的自由流動，因此具有更好的潤濕性[18]。

2.8 不同干燥方式蛋清蛋白的表面張力分析

表面張力是液體自由表面或兩種不相溶液體之間界面上的一種拉力，與蛋白質的乳化性和起泡性息息相關。從圖6C可知，在2.0～10.0的pH范圍內EWP-P的表面張力均大于EWP-D，這可能是EWPD較高的溶解度影響了蛋白質在界面的擴散速度所導致[36]。在pH2.0時，EWP-P和EWP-D的表面張力最大，分別為48.36±0.50和48.30±0.26 mN/m。隨著pH的增大EWP-P和EWP-D的表面張力均先減小后增大，與溶解度（圖6A）的趨勢相似，這可能是因為在酸性條件下，卵清蛋白表面的疏水基團會增加，從而降低了蛋白質分子在界面上吸附的動力學障礙，所以EWP-P和EWP-D的表面張力在酸性環境下更大[37]。

2.9 乳化能力和起泡能力分析

蛋白質的溶解度和表面張力等特性在決定其乳化能力等方面起著重要作用。如圖7A，EWP-P和EWP-D的乳化性隨著pH的增高先減小后增大，與溶解度（圖6A）和表面張力（圖6C）的趨勢一樣。pH為2.0時，兩者的乳化能力最好，其乳化性分別為5.98±0.04和6.25±0.02 m2/g，乳化穩定性分別為151.48和277.85 min。酸性環境下卵清蛋白表面暴露了更多的疏水氨基酸和帶電基團，可以有效地幫助乳狀液體系的形成和物理穩定，因此在酸性環境下EWP-P和EWP-D的乳化性和乳化穩定性均更高[37]。EWP-D的乳化性優于EWP-P，這是因為蛋白質的乳化性與其溶解度密切相關，溶解度較大，乳化性也相對較高[38]。此外，卵清蛋白是一種典型的含糖鏈的球蛋白，其糖鏈具有較強的界面吸附作用，有利于油水界面的乳化[39-40]。EWP-P在噴霧干燥時的美拉德反應消耗了蛋清蛋白中的糖，故其乳化性較小。

泡沫的形成依賴于由蛋白質形成的界面膜及其在懸浮液中保持氣泡和減緩聚結速率的能力，其中蛋白質的發泡能力和穩定性與蛋白與水相在界面上的相互作用有關，受蛋白分子柔性、凈電荷、構象和疏水性的影響[39-40]。蛋清蛋白在pH2.0～10.0條件下的起泡性如圖7C所示，EWP-D的起泡性優于EWPP，這可能是由于EWP-D的溶解度較高，在起泡過程中蛋白能迅速展開，形成能同時連接水相溶劑與空氣界面的兩性介質，而自身的帶電性又可產生一定的靜電排斥，使蛋白分子在空氣-水界面上呈現規律性排列，而不會發生聚集[19,41]。相比之下，EWP-P在高溫發生的美拉德反應會使蛋白形成更大的空間位阻，進而延緩了蛋白質在空氣/液體界面的吸附[1]。pH為6.0時，EWP-P和EWP-D的起泡性較低，分別是10.19%±1.01%和11.7%±0.66%，這是由于該pH下蛋白的溶解度和表面張力較低，蛋白易發生聚集，故不易形成泡沫。Dabbour等[19]研究向日葵蛋白時也發現所有的蛋白樣品在pH6.0時的起泡性最低，且冷凍干燥樣品的起泡性優于對流烘箱干燥樣品。另一方面，泡沫穩定性與蛋白膜的強度有關，蛋白質在攪打時，蛋白質分子被吸附在空氣-水界面，蛋白質分子重新排列，使其疏水部分朝向氣相方向，這種變化容易引起巰基的氧化，在空氣-水界面與相鄰的蛋白質分子中的巰基形成二硫鍵，從而增強界面膜的強度，有利于泡沫穩定性[1]。EWP-P的泡沫穩定性大于EWP-D，可能是因為噴霧干燥可能導致更多的蛋白質展開，表面游離巰基含量較多。另一方面可能是因為EWP-P發生了美拉德反應，在空氣-水界面上可以形成的厚的粘彈性美拉德產物層，有利于泡沫穩定性的增加[42]。Zeng等[43]研究不同干燥方式對雞皮膠原蛋白多肽時也發現噴霧干燥使其蛋白樣品的泡沫穩定性優于冷凍干燥樣品。

圖7 不同干燥方式蛋清粉的乳化能力和起泡能力Fig.7 Emulsifying ability and foaming ability of egg white powder by different drying methods

2.10 不同干燥方式蛋清蛋白的乳液微觀結構分析

EWP-P和EWP-D經高壓均質機均質0、1、2次后所得乳液的微觀結構如圖8所示。未高壓均質的蛋清蛋白乳液油滴大，且不均一，蛋白質容易從油水界面解離出來，使小油滴聚集形成大油滴。均質1次后蛋清蛋白乳液的油滴尺寸減小，分散性提高，且未發生團聚現象，其原因可能是高壓均質后，蛋清蛋白乳液被高壓剪切力切割形成小分子，使蛋清蛋白粒徑減小，更多的蛋白質吸附至油-水界面，為液滴間提供足夠的排斥力，從而阻止乳析的發生，使蛋清蛋白乳液的穩定性增強[44]。均質2次后，兩者均出現了小程度的團聚現象，形成了較大的油滴，這可能是因為均質次數增多，體系出現了“過處理”效應，高壓使蛋清蛋白乳液的油滴變小，油滴之間的運動速率加快，增加了相互碰撞的次數，從而破壞界面膜，導致油滴聚集[45]。劉競男等[44]研究高壓對大豆分離蛋白的影響時也發現隨著均質次數的增多，大豆分離蛋白的乳液體系出現了“過處理”效應，這被歸因為部分解離的大豆蛋白分子重新通過新的二硫鍵形成了聚集體。EWP-P的團聚現象比EWP-D的更明顯，可能是因為EWP-P的溶解度較低且表面巰基含量較高，故更易于聚集。以上結果表明，EWP-D乳液的穩定性高于EWP-P，說明真空冷凍干燥更有利于蛋清蛋白的乳液穩定。

圖8 不同干燥方式蛋清粉乳液的微觀結構（400×）Fig.8 Microstructure of egg white powder emulsion by different drying methods (400×)

3 結論

蛋清蛋白經過不同干燥方式干燥后，其結構會發生變化，從而導致理化和功能特性不同。噴霧干燥會使蛋清蛋白內部疏水基團和巰基暴露，同時還會與蛋清中的糖發生美拉德反應，最終使蛋白的溶解度、乳化性以及起泡能力下降，但其較高的表面疏水性有利于維持泡沫的穩定。冷凍干燥蛋清蛋白干燥前后的結構變化較小，蛋白基本保持原有的空間構象。相較于噴霧干燥蛋清蛋白，冷凍干燥蛋清蛋白具有較大的比表面積與溶解度，表面張力更小，因此蛋白的乳化能力和起泡性更優。隨著冷凍干燥技術與裝備的日益成熟，本研究的結果可為冷凍干燥蛋清蛋白在新食品開發與加工中的應用提供理論參考。