雙菌發酵對祛濕湯理化特性及風味的影響

陳 揚，梁泓波，李雅琪，王 琨，黎 攀，杜 冰

（華南農業大學食品學院，廣東廣州 510642）

三仁湯、赤小豆薏仁湯、參苓白術散等均是有名的祛濕方劑，具有健脾祛濕的功效[1-3]。其中，茯苓、白扁豆、薏米、杏仁、甘草均是具有祛濕作用的藥食同源材料，含有豐富的多糖[4]、黃酮[5]、蛋白[6]等成分。人們常常利用藥食同源材料制成湯以達到祛濕的目的，但清水煎制的祛濕湯存在營養價值不高和風味口感不佳[7]的問題。而對如何進一步提升祛濕湯的營養價值和風味口感的研究尚未見到。

發酵是借助酶與微生物的作用，在一定的環境條件下使食品通過發酵過程，改變其性能或是增強其功效的炮制方法。已有研究表明，益生菌發酵可以提高藥食同源材料中營養成分的含量，增強藥食同源材料的功效[8]。而單一菌種發酵產生的食品風味單一，混菌發酵能更好地增加風味[9]。目前有部分研究已公開了關于復合菌種發酵食品的報告，國內研究如周映君等[10]利用酵母菌與植物乳桿菌復合發酵了新會柑并提升了其的營養成分；吳珊珊等[11]利用酵母菌和乳酸芽孢桿菌研究開發了佛手果酒并優化了其工藝，提升了其風味。國外研究如Ogodo等[12]利用乳酸菌復合菌發酵了玉米粉以提高玉米粉的營養因子含量。由此可以推測：復合菌種發酵可能會提升祛濕湯的營養價值和風味口感。乳酸芽孢桿菌（Bacillussp.）DU-106是一種從傳統發酵奶酪中篩選出來的益生菌，有著耐酸和產酸能力強的特點，目前在發酵食品行業，特別是發酵藥食同源食品中有著廣泛的應用，對提高藥食同源材料的功能特性有著良好的作用[13-16]，且已有研究發現，利用乳酸芽孢桿菌對藥食同源材料進行接種發酵可以提高其活性成分[17]；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）是具有耐酸和發酵低聚果糖能力的益生菌[18]，其發酵生成物以乳酸為主[19]，有利于發酵后生成提高發酵物酸度。而利用乳酸芽孢桿菌DU-106以及植物乳桿菌復配發酵藥食同源材料水煎劑的研究尚未見到。因此，這兩種益生菌作為具有潛力的菌群，可共同運用于祛濕湯的發酵中。

鑒于此，本研究將采用乳酸芽孢桿菌DU-106與植物乳桿菌復配發酵的方式對茯苓、白扁豆、薏米、杏仁、甘草制成的祛濕湯進行發酵，并對其發酵前后的理化指標、風味物質和感官變化差異進行探究，以期為風味獨特、營養豐富、功效良好的新型祛濕飲料提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茯苓、白扁豆、薏米、杏仁、甘草 廣州仲正中藥飲片有限公司；乳酸芽孢桿菌（Bacillussp.）DU-106和植物乳桿菌，菌粉濃度為1×1012CFU/g 由華南農業大學新資源與功能性原料研究及評價中心鑒定及保藏；白砂糖 南字牌食品旗艦店；CuSO4·5H2O、C16H18ClN3S·3H2O、C4H4O6KNa·4H2O、NaOH、(CH3COO)2Zn、C2H4O2、K4Fe(CN)6·3H2O、Al(NO3)3、KOH、苯酚、醋酸銅結晶、酒石酸鉀鈉、碘化鉀、牛血清白蛋白、檸檬酸鈉、沒食子酸標準品等 均為分析純，廣州化學試劑廠；5% NaNO2標準溶液 上海麥克林生化科技有限公司。

PHS-3E型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；UV-1100型紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司；DHP600型電熱恒溫培養箱 北京市永光明醫療儀器廠；L-8900型全自動氨基酸分析儀

日本日立公司；QP2010 Ultra型氣相色譜-質譜聯用儀 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 祛濕湯的制備 將茯苓、白扁豆、薏米、杏仁、甘草分別洗凈后烘干，準確稱取茯苓20.0 g、白扁豆20.0 g、薏米20.0 g、杏仁8.0 g、甘草5.0 g，注入1200 mL純凈水，煮40 min；煮后裝于發酵罐中，封口，115 ℃ 30 min滅菌后，在超凈工作臺向發酵罐中添加3%（w/w）白砂糖；將0.1 g乳酸芽孢桿菌DU-106和植物乳桿菌的混合菌粉添加到100 mL生理鹽水中，活化30 min后，向發酵罐中添加3.3%菌種活化液質量的活化液，于28 ℃下密封發酵7 d。每日在超凈工作臺取樣于無菌離心管中，于-20 ℃冰箱中凍存。

1.2.2 pH、總酸與還原糖的測定 使用pH計對祛濕湯直接測定。祛濕湯總酸參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》[20]進行測定，折算系數以乳酸0.090計。祛濕湯還原糖參照GB 5009.7-2016《食品中還原糖的測定》[21]進行測定。

1.2.3 生物活性成分的測定

1.2.3.1 總多糖的測定 總多糖參照劉培等[22]的方法，采用苯酚硫酸法進行測定。精密吸取發酵0～7 d的祛濕湯0.8 mL于具塞試管，加水補至1 mL，加入5%苯酚1 mL后迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻，降至室溫后，置于沸水浴中加熱15 min，再置于冷水浴中降至室溫，隨行作空白對照，于490 nm處測吸光度。精密吸取D-葡萄糖對照品溶液0.15、0.30、0.45、0.60、0.75、0.90、1.00 mL，置于具塞試管中，精密吸取供試品溶液0.8 mL于具塞試管，加水至1 mL，后同上述法測定吸光度。每根試管做3個平行試驗，繪制標準曲線，計算得到標準曲線方程：y=5.0771x+0.0418 （R2=0.9991）。

1.2.3.2 總蛋白的測定 總蛋白參照周艷星等[23]的方法并稍作修改，采用雙縮脲試劑法進行測定。分別準確吸取1 mL發酵0～7 d的祛濕湯放入試管中，再依次加入4 mL雙縮脲溶液，搖勻，在室溫下反應30 min?？瞻兹芤鹤鳛閰⒄瘴铮诓ㄩL540 nm處測各管吸光度。在試管中分別精準吸取牛血清白蛋白標準品溶液0、0.2、0.6、0.8、1.0 mL的標準蛋白質溶液，用水補足到1 mL，后同上述法測定吸光度。每根試管做3個平行試驗，繪制標準曲線，計算得到標準曲線方程：y=0.3133x+0.0785 （R2=0.9991）。

1.2.3.3 總多酚的測定 多酚參照李娜等[24]的方法并稍作修改，采用福林酚法，以沒食子酸作為對照品進行測定。取1 mL發酵0～7 d的祛濕湯于試管中，分別加入1 mL福林酚顯色劑及3 mL 20% Na2CO3溶液，混勻后于50 ℃水浴中反應30 min。在765 nm波長下測定吸光度。準確稱取質量濃度為1000 mg/L的沒食子酸標準儲備液0、1.25、2.5、5、10、20、40 mL于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，配制成質量濃度為0、12.5、25、50、100、200和400 mg/L的系列標準溶液，分別取1 mL于試管中，后同上述法測定吸光度。每根試管做3個平行試驗，繪制標準曲線，計算得到沒食子酸標準曲線方程：

y=0.0055x+0.0842 （R2=0.9995）。

1.2.3.4 總黃酮的測定 黃酮參照李娜等[24]的方法并稍作修改，采用AlCl3比色法，以蘆丁作為對照品進行測定。取1 mL發酵0～7 d的祛濕湯置于25 mL容量瓶中，加70%乙醇至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，搖勻后放置6 min，加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻后再次放置6 min，加4%氫氧化鈉溶液10 mL，加70%乙醇至刻度，搖勻后放置15 min，以不加樣品的空白制劑按上述操作得到空白溶液，在510 nm處測定溶液吸光度。精密量取1 g/L的對照品溶液0、0.25、0.5、1、1.5、2、2.5 mL分別置于25 mL容量瓶中，按上述測量方法進行測定。每根試管做3個平行試驗，繪制標準曲線，計算得到蘆丁標準曲線方程：y=1.442x-0.022 （R2=0.9998）。

1.2.4 氨基酸組成的測定 參考GB 5009.124-2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》[25]并稍做修改，準確量取發酵第0～7 d樣品各5 mL分別倒入水解管中，加入5 mL 12 mol/L的鹽酸溶液，將水解管放入冷凍劑中冷凍5 min，充入氮氣，擰緊瓶蓋，放入110 ℃的電熱鼓風恒溫箱中水解23 h，再用濾紙過濾水解液，取1 mL過濾好的水解液置于燒杯中，60 ℃水浴蒸干，再加入1 mL一級水，再次蒸干，重復兩次。徹底蒸干后加入4 mL pH2.2的檸檬酸鈉緩沖溶液，振蕩混勻，吸取溶液通過0.22 μm濾膜后，轉移至儀器進樣瓶，注入氨基酸自動分析儀分析。檢測條件：色譜柱為陽離子樹脂柱LCAK06/Na；流動相為檸檬酸鈉A（pH3.45）與檸檬酸鈉B（pH10.85）；洗脫泵流速0.45 mL/min，衍生泵流速0.25 mL/min；檢測波長：570與440 nm；檢測溫度：58～74 ℃梯度升溫。

1.2.5 有機酸含量的測定 祛濕湯的有機酸參考GB/T 40179-2021[26]中測定有機酸的方法進行測定，色譜條件：Amnex HPX-87H色譜柱；流動相為0.1%磷酸水溶液；流速400 μL/min；柱溫40 ℃；紫外檢測器波長210 nm；手動進樣量20 μL。根據保留時間及峰面積分別定性及定量，對照標準曲線方程計算出物質含量。

1.2.6 揮發性風味物質的測定 祛濕湯的揮發性風味物質測定參照李婷婷等[27]的方法稍作修改后進行測定。分別稱取發酵第0～7 d樣品各5 g置于50 mL的頂空瓶中，錫箔紙密封，60 ℃水浴平衡5 min 后將65 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭插入頂空瓶中吸附30 min，萃取后將纖維頭插入氣相色譜系統解吸3 min，解吸溫度為250 ℃。

GC條件：毛細管柱為HP-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進樣口溫度240 ℃；進樣量2 μL；分流比5:1；溶劑延遲時間3.8 min；升溫程序：初始柱溫40 ℃，保持3 min后，以3 ℃/min升至230 ℃，保持2 min；載氣（He）流速1.88 mL/min。

MS條件：電子轟擊（EI）離子源；離子源溫度230 ℃，四級桿溫度150 ℃；質譜接口溫度250 ℃；離子化方式EI；電子能量70 eV；質量掃描范圍（m/z 29～500）。

將質譜數據經計算機在NIST 14譜庫檢索，結合手動檢索校對，選取匹配度大于800（最大值為1000）成分作為定性結果。

1.2.7 感官評定 感官評價小組由20名（男10名，女10名）通過感官分析培訓的食品專業人員組成，分別從色澤、香氣、滋味和外觀澄清度方面對發酵第0、3、5及7 d的發酵祛濕湯進行感官評定，詳細的感官評分標準如表1所示[28]。

表1 發酵祛濕湯感官評定標準Table 1 Sensory evaluation of fermented Qushi decoction

1.3 數據處理

采用單因素方差分析的方法，運用SPSS 25.0軟件進行顯著性分析，P＜0.05表示差異顯著；采用Microsoft Office Excel 2010與GraphPad Prism 5.0軟件進行繪圖分析。所有實驗重復三次，實驗結果以平均值±標準誤差（mean±SD）的方式表示。

2 結果與分析

2.1 祛濕湯發酵過程中pH和總酸的變化

pH和總酸與祛濕湯的品質密切相關，是祛濕湯發酵過程中重要的理化指標。祛濕湯發酵過程中pH和總酸的變化如圖1和圖2所示。由圖1可知，祛濕湯的pH隨時間的延長而降低，在發酵前期pH迅速下降，在發酵4 d后降到3以下，后趨于穩定。這是因為在發酵前期乳酸菌大量產酸，導致初期pH迅速下降；到達發酵后期，低pH環境影響了菌種的生長，pH進入穩定期[28]，發酵前期與后期的pH具有顯著性差異（P＜0.05）。由圖2可知，祛濕湯的總酸隨時間的延長而升高，并在第7 d達到峰值11 g/kg，表明祛濕湯的pH與總酸含量與發酵時間有密切聯系。對比張平等[29]使用植物乳桿菌發酵梨汁的研究，其pH最終未下降到3以下，而DU-106與植物乳桿菌復配發酵后產酸更多，在發酵后期pH更低。

圖1 發酵過程中pH隨時間的變化Fig.1 pH changes with time during fermentation

圖2 發酵過程中總酸隨時間的變化Fig.2 Changes of total acid over time during fermentation

2.2 祛濕湯發酵過程中還原糖的變化

還原糖的變化也與祛濕湯的品質相關，也是祛濕湯發酵過程中的一個重要的理化指標。祛濕湯發酵過程中還原糖的變化如圖3所示。由圖3可知，祛濕湯的還原糖含量隨時間的延長而降低，發酵初期還原糖含量迅速降低，這是因為在發酵前期，乳酸菌消耗還原糖；在發酵4 d后趨向穩定。這表明乳酸菌需要消耗還原糖來產酸，祛濕湯中還原糖的含量會影響產酸量。

圖3 發酵過程中還原糖隨時間的變化Fig.3 Changes of reducing sugar over time during fermentation

2.3 祛濕湯發酵前后生物活性成分的變化

2.3.1 祛濕湯發酵前后多糖的變化 多糖具有免疫調節、抗衰老、降血脂、抗病毒、抗炎等多種藥理作用，是祛濕湯中重要的一個活性成分。有研究表明，益生菌可以通過分解培養基中的有機物質，提高發酵后多糖的含量[30]。通過對祛濕湯發酵過程中的總多糖含量的測定發現，發酵第0～7 d的多糖含量分別為19.08、19.08、19.14、19.61、20.14、20.53、20.80、20.95 mg/mL，多糖含量在發酵過程中顯著提高（P＜0.05），見圖4。這與何彩文等[31]利用酵母粉發酵茯苓以提高茯苓多糖含量的研究結果一致。

圖4 發酵過程中多糖隨時間的變化Fig.4 Changes of polysaccharides over time during fermentation

2.3.2 祛濕湯發酵前后蛋白的變化 在藥食同源中藥中，存在著生物大分子蛋白質，其種類豐富，功能各異，已被證明有抗腫瘤、抗炎、免疫調節等作用[32]。Yin等的研究表明，微生物可以通過利用薏米中纖維素或是半纖維素酶解后生成的可溶性糖，從而提高蛋白質的含量[33]，而薏米蛋白有較好的健脾祛濕的功能[34]。通過對祛濕湯發酵過程中的蛋白含量的測定發現，發酵第0～7 d的蛋白含量分別為0.90、0.91、0.97、1.14、1.39、1.47、1.58、1.66 mg/mL，蛋白含量在發酵過程中顯著提高（P＜0.05），見圖5。對比Yin等[33]的研究中，發酵薏米的蛋白含量并未得到提升，雙菌發酵祛濕湯更具優勢。

圖5 發酵過程中蛋白隨時間的變化Fig.5 Changes in protein over time during fermentation

2.3.3 祛濕湯發酵前后多酚的變化 天然中草藥中廣泛存在著多酚化合物，其具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗腫瘤等活性[35]。通過測定祛濕湯發酵過程中的多酚含量發現，發酵第0～7 d的多酚含量分別為

32.68、32.72、32.75、37.81、43.20、46.25、49.80、52.45 μg/mL，多酚含量在發酵過程中得到顯著性提升（P＜0.05），見圖6。有研究表明，乳酸菌能夠將植物細胞中的活性物質，轉化成為其代謝產物并產生新的酚類化合物，且多酚含量越高，其潛在生物學功效越強[36]。

圖6 發酵過程中多酚隨時間的變化Fig.6 Changes in polyphenols over time during fermentation

2.3.4 祛濕湯發酵前后黃酮的變化 黃酮類化合物是一種很強的抗氧化劑，可有效清除體內的氧自由基, 具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎等生物活性[37]。通過對祛濕湯發酵過程中的黃酮含量的測定發現，發酵第0～7 d的黃酮含量分別為45.79、45.84、46.17、46.42、49.10、50.53、52.44、53.26 μg/mL，黃酮含量在發酵過程中顯著提升（P＜0.05），見圖7。這可能是微生物發酵促使祛濕湯中酶的活力增加，從而合成新的黃酮類化合物[38]。有研究表明，黃酮含量越高，其功效越強[39]。對比易橋賓等[40]的研究，自然發酵可可豆后其多酚與黃酮含量未得到提升，雙菌發酵祛濕湯可以顯著提升祛濕湯中多酚與黃酮的含量（P＜0.05），更具優勢。由此可以猜測，DU-106與植物乳桿菌復配發酵可以通過酶降解的作用，有效利用藥食同源材料中的有機物質增加祛濕湯中多糖、蛋白、多酚和黃

圖7 發酵過程中黃酮隨時間的變化Fig.7 Changes in flavonoids over time during fermentation

酮的含量，從而提高祛濕湯的功效。

2.4 祛濕湯發酵前后水解氨基酸的變化

由表2可知，發酵第0～7 d的祛濕湯均含有18種氨基酸；各個樣品均含有7種人體必需氨基酸（Essential amino acid，EAA）（色氨酸未檢測），總氨基酸含量（Total amino acids, TAA）隨發酵時間的增加而增加，在發酵第7 d祛濕湯的EAA和NEAA含量都得到顯著提升（P＜0.05），EAA含量最高為65.00 mg/100 g，TAA達到最大值為429.00 mg/100 g。有研究表明，F值越大說明蛋白質潛在的生物活性可能越好[41]。由表2可知，乳酸菌發酵后F值提高了，說明發酵可以提高祛濕湯的潛在生物活性功能。

表2 發酵祛濕湯的氨基酸含量Table 2 Amino acid content of fermented Qushi decoction

2.5 祛濕湯發酵前后有機酸的變化

由2.1可知，祛濕湯總酸含量隨發酵時間的增加而上升，這是因為乳酸菌在不斷地產酸。通過對祛濕湯發酵前后的乳酸含量的測定得出，發酵第0 d的乳酸含量為0.02 mg/g，發酵第7 d的乳酸含量顯著提升（P＜0.05），達到最大值為6.83 mg/g。由表3可知，對比其他有機酸，乳酸含量增加幅度最大。證明乳酸含量的增加是總酸含量增加的關鍵因素。

表3 祛濕湯中五種有機酸的標準曲線方程以及發酵前后含量變化Table 3 Standard curve equation of five organic acids in Qushi decoction and the changes of their contents before and after fermentation

2.6 祛濕湯發酵前后揮發性風味物質變化分析

揮發性香氣是發酵食品重要的品質之一，很大程度上會影響消費者接受程度和偏好[42]。采用頂空固相微萃取-氣質聯用技術對第0～7 d的發酵祛濕湯進行分析，如表4所示，共測得65種揮發性物質，其中包括烯類9種，醇類18種，酯類6種，酮類10種，醛類18種和其他物質4種。發酵第0～7 d的祛濕湯分別檢測出香氣物質25、22、21、31、21、27、30和31種，前2 d正己醛、辛醇的相對含量較高，呈花果香氣；后6 d苯甲醛的相對含量均為最高，分別為25.83%、53.72%、60.16%、60.40%、67.82%和64.75%；苯甲醛具有杏仁香氣，是杏仁原料本身的特征香氣。

表4 祛濕湯發酵前后的揮發性物質Table 4 Volatile compounds of Qushi decoction before and after fermentation

對于發酵的祛濕湯來說，雖然醛類、酯類以及醇類等物質不是含量最高的物質，但是由于它們的閾值較低，它們對發酵祛濕湯香氣也有重要的貢獻。在發酵0 d組中，含量比較高的是醛類；接種乳酸菌后，由于乳酸菌進行乳糖、氨基酸等的物質代謝時，可使得相應的醛類物質通過脫氫酶還原形成某些醇[43]；經過乳酸菌發酵后，大量的酸被產生，酸與醇類物質發生酯化反應生成酯類物質，因此酯類和醇類物質種類和含量得到提升，豐富了祛濕湯的風味。

續表 4

續表 4

2.7 發酵前后祛濕湯的感官評價

感官品質是食品是否可以獲得消費者認可的關鍵指標。發酵第0、3、5和7 d的祛濕湯感官評定結果如表5所示。從色澤上看，各組發酵祛濕湯色澤均勻，顏色微微發黃。在其氣味上，發酵第0 d組無發酵香氣，發酵時間越長，發酵香氣越濃，各組均無其他異味，差異較為明顯。從滋味來看，發酵第0 d組無發酵酸味、滋味較為單一；第3 d組與第5 d組酸度不夠濃郁；發酵第7 d組滋味協調、酸甜適中。從外觀澄清度上看，每組得分差別不大，均無大量沉淀。綜合得分高低為：發酵第7 d組＞發酵第5 d組＞發酵第3 d組＞發酵第0 d組。發酵第7 d組是4個發酵組中感官品質最好的；發酵0 d組的氣味、滋味較其他組差。復合菌發酵在一定程度上改善了祛濕湯的香氣與滋味，使得香氣具有獨特的發酵風味，更受人們喜愛。

表5 發酵祛濕湯的感官評價Table 5 Sensory evaluation of fermented Qushi decoction

3 結論

本試驗探究了乳酸芽孢桿菌DU-106與植物乳桿菌復配發酵對祛濕湯理化性質和風味口感的影響。結果表明：發酵過程中，乳酸芽孢桿菌DU-106和植物乳桿菌發酵能通過消耗還原糖來顯著降低pH、提高總酸含量，最高可達11.00 g/kg。多糖、蛋白質、多酚、黃酮等活性成分的含量也隨發酵時間的增加而提高，且在發酵第7 d達到最大含量，含量分別為20.95、1.66 mg/mL、52.45、53.26 μg/mL?？偘被岷?、必需氨基酸含量和F值也隨發酵時間的增加而增加，且在發酵第7 d達到最大值為429 mg/100 g，必需氨基酸含量最高為65 mg/100 g。有機酸特別是乳酸在發酵后含量大大增加，含量最高達到6.83 mg/g。由此可猜測，發酵可以通過提高祛濕湯中的活性成分種類及含量，從而提升祛濕湯的功效及營養價值。益生菌發酵后能顯著改變祛濕湯香氣成分，增加酯類和醇類物質的種類及相對含量，使得祛濕湯獲得特殊的發酵香氣。發酵后的祛濕湯在活性成分含量及風味方面都比發酵前組有所提升。

因此，雙菌發酵有利于從多個方面提升祛濕湯的品質，解決祛濕湯營養價值不高和風味口感不好的問題。發酵后祛濕湯的功效評價仍需進一步探索。本研究為發酵技術提高祛濕湯功效或是藥食同源材料祛濕產品開發提供了前期的基礎和理論依據。