大豆過敏原夾心ELISA和競爭ELISA方法的建立及其在加工食品中應用研究

朱禮艷，李思越，黃建聯(lián)，江銀梅，萬 碩，趙金龍，李振興,

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部冷凍調(diào)理水產(chǎn)品加工重點實驗室，福建廈門 361022；2.安井食品集團股份有限公司，福建廈門 361022；3.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266003）

大豆蛋白因其高營養(yǎng)價值和功能特性，成為食品工業(yè)中最重要的植物蛋白來源之一[1]。研究表明食用大豆有降低血漿膽固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白等有益作用。因此大豆蛋白如今被廣泛用于肉類、乳制品、烘焙產(chǎn)品和食用醬等原料中[2]。但是，大豆也是公認的八大食物過敏原之一，是人類常見的食物過敏原[3]。大豆過敏的患病率在一般人群中約為0.3%～0.4%，幼兒比成人更容易受到影響[4]。大豆過敏患者癥狀輕微時會出現(xiàn)嘴唇或面部腫脹、皮膚紅腫、抽搐、嘔吐、肚痛或肚瀉等，嚴重時可能會導致過敏性休克，甚至死亡[5]。

一些研究已經(jīng)證明至少有16種過敏原可以與大豆過敏患者血清的IgE結合，其中Gly m Bd 28K、Gly m Bd 30K和β-伴大豆球蛋白的α亞基（Gly m Bd 60K）是大豆中的主要過敏原[6]。眾所周知，對食物過敏唯一有效的治療方法就是避免食用這些食物，但是現(xiàn)在食物配料多種多樣，食物的組成變得十分復雜，很難避免食用大豆成分[7]。因此，建立針對大豆過敏原的方便、快捷、靈敏、特異的檢測方法，對于保護大豆過敏患者的消費安全和身體健康有重要的現(xiàn)實意義。

目前，針對大豆過敏原的檢測主要有液相色譜技術、生物傳感器、生物質(zhì)譜技術等，其中酶聯(lián)免疫吸附方法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）具有操作簡便、快速、靈敏度高、特異性強、經(jīng)濟等特點[8-10]。但是在對大豆過敏原的ELISA檢測方法的研究中，研究較多的過敏原是β-伴大豆球蛋白、Gly m 4、Gly m 8等單一過敏原，針對混合過敏原蛋白的ELISA研究報道較少[11-13]。混合過敏原蛋白可以制備出含有諸多抗體位點的抗體，這樣抗體可最大程度上與抗原及待檢樣品結合，較準確地對潛在過敏原進行檢測，不容易出現(xiàn)漏檢的情況[14]。因此，本研究選擇大豆多組分混合過敏原蛋白作為免疫原，建立雙抗夾心ELISA方法和間接競爭ELISA方法[15-17]，用這兩種方法來檢測加工條件下的樣品，比較在實際加工樣品和真實食物樣品中的檢測能力，并確定這兩種方法各自適用的檢測條件，從而為大豆過敏原便捷、準確、快速檢測提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大豆 東北農(nóng)業(yè)大學種植；羊多抗血清、兔多抗血清 北京華大蛋白公司制備；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗兔IgG、兔抗羊IgG、TMB單組份顯色液、牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA） 北京索萊寶科技有限公司；吐溫20、磷酸二氫鉀、氯化鉀、氯化鈉、磷酸氫二鈉、濃硫酸、丙酮 均為分析純；BCA蛋白定量試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；高筋小麥粉、低筋小麥粉、黃油 益海嘉里金龍魚糧油食品股份有限公司；細砂糖 廣州市華僑糖廠；豆奶、醬油、餅干、黃豆醬、芝麻糊、雞蛋、牛奶等食品 均購自青島利群超市。

800TS吸收光酶標儀 美國BioTek公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆混合過敏原的提取 先將大豆研磨成細小粉末，過80目篩后，收集大豆粉，之后在4 ℃條件下，加入一定量的丙酮，脫脂、脫色；按照1:10（g/mL）比例加入細胞裂解液，在室溫條件下充分混勻（約3 h），之后在12000 r/min，4 ℃條件下離心20 min，收集上清液，將上清液通過0.22 μm的濾膜過濾，得到大豆多組分混合過敏原溶液，于-20 ℃保存。

1.2.2 多克隆抗體的制備 羊多抗血清和兔多抗血清是由北京華大蛋白公司制備，具體操作步驟如下：用1.2.1提取得到的大豆混合過敏原溶液免疫羊和新西蘭雄兔，用不含大豆蛋白的飼料喂養(yǎng)剛斷奶的小羊和新西蘭兔，待體重達到2 kg左右時進行免疫，每隔兩周加強免疫一次，共免疫4次。在第三次免疫后，可對羊和兔進行少量血液的采集，之后利用間接ELISA法測定抗體效價，合格后，經(jīng)過一次的沖擊加強免疫，可大量采血。采血前這兩種動物禁食24 h，以防血脂過高。得到的血液于37 ℃靜置2 h，之后4 ℃過夜，次日9500 r/min，4 ℃條件下離心20 min，分裝并于-80 ℃保存。

得到的血清采用Protein A/G親和層析柱進行純化。取少量的血清與等體積的1 mol/L Tris-HCl緩沖液（pH8.0）混合，上樣于預先用0.15 mol/L NaCl（pH7.0）的緩沖液平衡好的Protein A/G Sepharose親和層析柱。依次用0.15 mol/L NaCl、20 mmol/L Na2HPO4（pH7.0）的緩沖液流洗，0.1 mol/L甘氨酸（pH3.0）的緩沖液洗脫。最終獲得純化的IgG抗體，將純化的多克隆抗體進行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析[18]，分裝后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 夾心ELISA定量檢測方法的建立

1.2.3.1 夾心ELISA基本檢測程序 用碳酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH9.6）稀釋多克隆抗體到一定質(zhì)量濃度，加入96孔酶標板中，每孔100 μL，4 ℃過夜。然后用PBST（PBS含0.05%吐溫-20，pH7.4）洗滌3次，每孔300 μL，每次5 min左右，棄去洗滌液，在吸水紙上將酶標板拍干，之后的洗滌步驟與此步驟完全相同。用1% BSA封閉，37 ℃溫育120 min左右，洗滌拍干后，每孔加入100 μL標準溶液（大豆混合過敏原溶液、食物樣本或者PBST作為對照），37 ℃孵育60 min后洗滌拍干，接著每孔加入100 μL一定濃度的另一株多克隆抗體，37 ℃孵育60 min后洗滌拍干；之后每孔加入100 μL稀釋到一定倍數(shù)的酶標抗體溶液，在37 ℃反應30 min后洗滌拍干，TMB底物溶液避光顯色10 min，最后以2 mol/L H2SO4溶液終止反應，測定OD450值，計算P/N值（其中P為陽性樣品值，N為陰性對照值）[19-20]。

1.2.3.2 捕獲抗體、檢測抗體和酶標二抗工作濃度的選擇 在相同的反應條件下，采用1.2.3.1節(jié)的步驟分別對羊多克隆抗體（捕獲抗體）（1:3000、1:5000、1:8000、1:10000、1:12000）、兔多克隆抗體（檢測抗體）（1:4000、1:6000、1:8000、1:10000、1:12000）和酶標二抗（1:5000、1:8000、1:10000、1:12000、1:15000）進行檢測，將抗原濃度設置為陽性5 μg/mL，PBST代替抗原為陰性，測定OD450值，并計算P/N值，確定最佳稀釋度。

1.2.3.3 檢測時間的確定 在抗體最佳工作濃度條件下，采用1.2.3.1節(jié)的步驟分別對抗原孵育時間（30、60、90 min）、檢測抗體孵育時間（30、60、90 min）、酶標二抗工作時間（30、60、90 min）、TMB顯色時間（5、10、15 min）進行實驗。將抗原濃度設置為陽性5 μg/mL，PBST代替抗原為陰性，測定OD450值，并計算P/N值，確定最佳檢測條件。

1.2.3.4 標準曲線制作 按照確定好的實驗條件，檢測不同濃度抗原（0.0078～30 μg/mL），測定OD450值并繪制校準曲線，找出線性范圍，確定最終的標準曲線。

1.2.4 競爭ELISA定量檢測方法的建立

1.2.4.1 競爭ELISA基本檢測程序 將大豆過敏原用0.05 mol/L pH9.6 CBS稀釋液稀釋后，各孔加100 μL于96孔酶標板中，4 ℃包被過夜后拍干，用PBST洗滌緩沖液重復洗滌三次，每次5 min，棄去洗滌液，在吸水紙上將酶標板拍干，之后的洗滌步驟與此步驟完全相同。用5%脫脂奶粉封閉液進行封閉，每孔加入300 μL，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中封閉120 min后，棄掉封閉液，用PBST洗滌緩沖液洗滌拍干；將50 μL一抗和50 μL不同濃度的蛋白溶液混合，在37 ℃預孵育10 min后加入孔內(nèi)，每孔100 μL，37 ℃恒溫孵育90 min后將液體倒出，洗滌拍干；將稀釋到一定倍數(shù)的酶標二抗加入所有孔中，每孔100 μL，37 ℃恒溫孵育60 min后將液體倒出，洗滌拍干，TMB底物溶液避光顯色10 min，最后以2 mol/L H2SO4溶液終止反應，測定OD450值[21-22]。

1.2.4.2 最佳包被抗原濃度的優(yōu)化 以制備得到的大豆過敏原（10 mg/mL）為標品，從蛋白濃度為10 μg/mL時開始進行梯度稀釋，兔多克隆抗體以稀釋倍數(shù)為2×104時開始往下稀釋。選擇吸光度值在1.3附近，且空白值低于0.1的參數(shù)為最終工作濃度。

1.2.4.3 最佳一抗、二抗工作濃度的優(yōu)化 將抗原稀釋至最佳濃度，進行包被，來優(yōu)化兔多克隆抗體和羊抗兔酶標二抗的工作濃度。兔多克隆抗體的稀釋倍數(shù)為1×104、2×104、4×104、8×104、1.6×105，分別在96孔板中縱向加入，羊抗兔酶標二抗的稀釋倍數(shù)為2×104、4×104、8×104、1.6×105、3.2×105，分 別 在96孔板中橫向加入。用棋盤法選擇吸光度值在1.3附近，且空白值低于0.1的參數(shù)為最終工作濃度。

1.2.4.4 標準曲線制作 確定抗原、抗體最佳的工作濃度后，按照1.2.4.1的操作步驟測定不同大豆過敏原濃度下的吸光度值。以大豆過敏原作為競爭物，起始濃度為100 μg/mL，以4倍梯度稀釋，共12個濃度，在最優(yōu)條件下進行競爭ELISA實驗。將標準品各濃度的OD值換算成B/B0（其中B為各蛋白濃度在450 nm下的OD值，B0是空白對照的平均值），以B/B0為縱坐標，相應標準品的濃度為橫坐標，制作標準曲線。依據(jù)四參數(shù)擬合公式y(tǒng)=（A-D）/[1+（x/C）-B]+D對該曲線進行擬合（其中D表示吸光度下限值，代表著S型曲線的下漸近線；而A表示吸光度上限值，代表著S型曲線的上漸近線；C為吸光度增長速度開始發(fā)生變化的濃度值；B為吸光度增加速率參數(shù)，相當于曲線的斜率）。依據(jù)LOD=B0-3SD（SD為空白對照的標準偏差）計算檢測限。

1.2.5 實際加工樣品的制備 本研究中制備兩種實際加工食品，分別是面包和蛋糕，進行實際樣品回收率的測定，這種方法能夠評估加工對提取和回收目標蛋白的實際影響以及檢測效率。

制作面包的過程為：將5 g酵母加在125 g水中攪拌至酵母融化，再將250 g高筋小麥粉、50 g細砂糖、30 g黃油和50 g雞蛋加入進行和面，直至面團能抻成很薄的薄膜，之后將面團靜置醒發(fā)30 min，將成型好的面團放入烤盤中再次醒發(fā)，醒發(fā)至原體積的2～3倍，烤爐預熱至上火180 ℃，下火200 ℃，烘烤15 min，取出冷卻后即可。在本實驗中需要兩種面包，一種是未添加大豆的面包，一種是添加大豆的面包（在烘烤前將一定量的大豆粉均勻的鋪在面團表面）。烘焙結束后，按照最佳前處理方法對兩種面包進行蛋白提取，待用。

制作蛋糕的過程為：將5個雞蛋蛋白用打蛋器打至粗泡狀態(tài)，在蛋白里加入15 g細砂糖，繼續(xù)打至細膩的泡沫，再加入15 g細砂糖，繼續(xù)打至可呈現(xiàn)紋路的狀態(tài)，最后再加入20 g的細砂糖，繼續(xù)打至干性發(fā)泡的狀態(tài)（當提起打蛋器的時候，蛋白能拉出一個短小直立的尖角），另外將5個蛋黃與30 g細砂糖攪拌均勻至蛋黃顏色變淺，再邊攪拌邊加入50 mL色拉油和50 mL牛奶，最后篩入90 g低筋小麥粉，慢慢地攪勻至光滑細膩無顆粒。蛋黃糊攪拌完成后，取蛋白霜入蛋黃糊中，翻拌均勻至光滑細膩無顆粒。把蛋糕放入預熱好的烤箱中，上下火，170 ℃，烘烤40 min，取出即可。在本實驗中需要兩種蛋糕，一種是未添加大豆的蛋糕，一種是添加大豆的蛋糕（在烘烤前將一定量的大豆粉均勻的鋪在面團表面）。烘焙結束后，按照最佳前處理方法對兩種蛋糕進行蛋白提取，待用。

1.2.6 加標樣品的制備 將三種不含大豆蛋白的食物（橙汁、巧克力、牛肉醬）打碎，然后將1 g食物碎加入總體積為5 mL的0.01 mol/L pH8.5 CBS（含0.05% SDS和0.05% DTT）中，用提取得到的大豆混合過敏原溶液進行加標，使終濃度為0.5、2、5 μg/mL。在4 ℃下渦旋振蕩孵育1 h，然后10000 r/min離心10 min，取上清液，進行ELISA實驗，每個梯度重復3次，根據(jù)下式計算回收率。

1.2.7 真實食物樣品的制備 從超市購買豆奶、醬油、餅干、黃豆醬、芝麻糊5種經(jīng)過劇烈加工過的食品，這些食品經(jīng)過了發(fā)酵或高溫烘焙等，采用雙抗夾心ELISA和競爭ELISA分別檢測其中是否含有大豆過敏原，對檢測結果進行分析比較。提取步驟與上述相同。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，所有數(shù)據(jù)為3次重復的平均值±標準差。并運用Origin軟件進行作圖，采用IBM SPSS Statistics 19.0（SPSS，Chicago，Illinois，USA）進行單因素方差分析等統(tǒng)計學分析，查看樣本顯著性（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 大豆混合過敏原的制備

提取后的大豆混合過敏原溶液經(jīng)BCA蛋白定量試劑盒定量后，通過SDS-PAGE電泳進行分析。如圖1所示。

圖1 大豆混合過敏原的SDS-PAGE結果Fig.1 SDS-PAGE results of soybean mixed allergens

大豆中過敏原蛋白眾多，致敏原數(shù)據(jù)庫共收錄38種，包括16種IgE介導的過敏原。但目前根據(jù)蛋白含量多少和致敏能力的大小，大豆球蛋白（22、

52～55 kDa）、Gly m Bd 30K（30～35 kDa）、Gly m Bd 28K（28 kDa）和β-伴大豆球蛋白（50、63～67、75 kDa）被認為是大豆中最主要的過敏原。通過SDS-PAGE結果，可以看到主要的過敏原均已提取得到，與文獻中所報道的情況基本一致[6]。

2.2 兔多抗和羊多抗純化結果

將兔血清和羊血清進行Protein A/G親和層析柱純化后，得到的SDS-PAGE結果如圖2所示。純化的IgG抗體的分子量為150 kDa左右，本實驗采用還原性電泳，泳道1和2顯示，IgG在還原條件下主要顯示為25 kDa的輕鏈和50 kDa的重鏈，說明經(jīng)過Protein A/G親和層析柱的純化，得到了純度較高的兔多克隆抗體和羊多克隆抗體。

圖2 Protein A/G柱純化兔多抗和羊多抗的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of polyclonal antibodies of rabbit and sheep purified by protein A/G column

2.3 夾心ELISA定量檢測方法的建立

2.3.1 最佳捕獲抗體、檢測抗體和酶標二抗工作濃度的確定 如圖3顯示，當捕獲抗體稀釋5000倍時，P/N值最大；當檢測抗體稀釋8000倍時，P/N值最大；當酶標二抗稀釋10000倍時，P/N值最大。最終考慮抗體等試劑的價格因素和食品安全風險因素等最終確定了如下實驗條件，羊多克隆抗體用作捕獲抗體以5000倍稀釋；兔多克隆抗體作為檢測抗體以8000倍稀釋；酶標二抗以10000倍稀釋。

圖3 夾心ELISA的抗體稀釋倍數(shù)優(yōu)化Fig.3 Optimization of antibody dilution ratio of sandwich ELISA

2.3.2 最佳檢測時間的確定 如圖4所示，隨著抗原孵育時間和TMB顯色時間的增加，OD值也在增加，但由于整個反應過程陰性空白OD值非常低，故P/N值也在增加，當抗原孵育時間為60 min、TMB顯色時間為10 min時，OD值已經(jīng)超過1.0，滿足實驗要求，所以為了節(jié)省檢測時間，提高檢測效率，確定抗原孵育時間為60 min，TMB顯色時間為10 min。當檢測抗體孵育時間和酶標二抗工作時間增加到90 min時，P/N值均開始降低且OD值增加不多，故選擇60 min作為檢測抗體的孵育時間和酶標二抗的工作時間。

圖4 夾心ELISA的工作時間優(yōu)化Fig.4 Optimization of ELISA working time

2.3.3 標準曲線的確立 在上述最適反應條件下制作標準曲線，將抗原設置為不同濃度（0.0078～30 μg/mL），并進行線性回歸分析，選取其中具有線性關系的標準濃度范圍（0.0625、0.25、1、2、3、4、6 μg/mL），繪制標準曲線。此曲線的回歸方程為y=0.2333x+0.0692，R2為0.995，其中x表示抗原的濃度，y表示不同濃度抗原的吸光度，從結果來看，該標準曲線的線性關系良好。

2.4 競爭ELISA定量檢測方法的建立

2.4.1 最佳抗原包被濃度的確定 結果如表1所示。從橫向看，隨著抗原濃度的降低，OD值也越來越低，當抗原濃度為2.5 μg/mL時，已經(jīng)達到飽和，因此最終確定包被抗原的濃度為2.5 μg/mL。

表1 棋盤法優(yōu)化包被抗原的濃度Table 1 Results of chessboard method for optimination coating concentration

2.4.2 最佳一抗、二抗工作濃度的優(yōu)化 結果見表2。當兔多克隆抗體稀釋倍數(shù)為20000倍時，已經(jīng)達到飽和，當稀釋倍數(shù)從2×104倍增加到4×104倍時，吸光度值有非常明顯的降低，故可先將一抗稀釋倍數(shù)定為20000倍，再觀察二抗，當二抗稀釋倍數(shù)為8×104倍時，OD值可達到1.3，且背景值很低，所以可將二抗稀釋倍數(shù)定為80000倍。因此，確定包被抗原的最終濃度為2.5 μg/mL，兔多克隆抗體最佳稀釋倍數(shù)為20000倍，HRP標記羊抗兔IgG的最佳稀釋倍數(shù)為80000倍。

表2 棋盤法優(yōu)化一抗和二抗的工作濃度Table 2 Results of chessboard method for optimination of primary antibody and secondary antibody

2.4.3 標準曲線的建立 確定抗原、抗體最佳的工作濃度后，按照1.2.4.1的操作步驟測定不同大豆過敏原濃度下的吸光度值。從結果來看（圖5），檢測范圍為10～100000 ng/mL，最低檢測限為10 ng/mL。

2.5 競爭ELISA方法和雙抗夾心ELISA方法的分析比較

2.5.1 實際加工樣品回收結果 在面包和蛋糕進行烘烤前，將3.0 g大豆粉揉搓在20.0 g面團中，進行烘焙。制作完成后，按照大豆過敏原的提取方法對自制的面包和蛋糕進行蛋白的提取，將提取的蛋白適度稀釋后，用競爭ELISA方法和雙抗夾心ELISA方法分別檢測空白樣品和加入大豆過敏原的加工樣品。大豆中蛋白的含量約在40%～50%，可根據(jù)此數(shù)據(jù)進行回收率的計算。添加回收結果見表3。

表3 競爭ELISA法和雙抗夾心ELISA法添加回收結果Table 3 Results of actual processed samples by competitive ELISA and double-antibody sandwich ELISA

從結果來看，在經(jīng)過高溫烘烤等劇烈加工后的食物樣品，競爭ELISA檢測后的回收率要高于雙抗夾心ELISA的回收率，該結果與De等[21]的研究結果一致。這可能都是因為在劇烈的加工條件下，某些過敏原上的多個抗原表位被破壞，兩株抗體不能識別過敏原上的兩個不同的表位，而競爭ELISA中抗體只需要識別單個表位，所以某些夾心ELISA方法檢測不到的蛋白，競爭ELISA方法可以檢測得到。

2.5.2 加標食品回收結果 將提取得到的大豆混合過敏原溶液加入三種不含大豆蛋白的食物（橙汁、巧克力、牛肉醬）中，使終濃度為0.5、2、5 μg/mL，用雙抗夾心ELISA方法和競爭ELISA兩種方法來進行加標實驗，根據(jù)檢測結果計算回收率。結果見表4。

表4 競爭ELISA法和雙抗夾心ELISA法加標回收結果Table 4 Results of competitive ELISA method and double-antibody sandwich ELISA method for the detection of labeled food

當基質(zhì)樣品為橙汁時，從結果中可以看出雙抗夾心ELISA方法檢測得到的回收率要高于競爭ELISA，橙汁中成分簡單，加工不復雜，在這種環(huán)境中，夾心ELISA方法的準確性和靈敏度均是要由于競爭ELISA方法，這與Segura等[23]的研究一致。但是在巧克力和牛肉醬中，當大豆過敏原的加標濃度較低（0.5 μg/mL）時，雙抗夾心ELISA中沒有檢測到大豆過敏原，而競爭ELISA方法中檢測到了大豆過敏原的存在，回收率為68%和76%，回收率不高的原因可能是因為基質(zhì)中成分的復雜，基質(zhì)效應的影響，但整體上在這種基質(zhì)中成分較多，加工較為復雜的食物樣品檢測中，競爭ELISA方法還是較為適用的。

2.5.3 真實樣品檢測結果 除了對實際樣品進行加標回收實驗，還購買了五種在售食品，分別是豆奶、醬油、餅干、黃豆醬、芝麻糊，在這幾種食物的標簽上，豆奶、醬油和黃豆醬這三種分別標注了大豆成分，餅干和芝麻糊這兩種食物標簽上未標注大豆成分。采用競爭ELISA和雙抗夾心ELISA方法對這5種食物進行檢測，結果如表5。

表5 競爭ELISA法和雙抗夾心ELISA法對真實食品的檢測結果Table 5 Results of competitive ELISA and double-antibody sandwich ELISA on real food

結果顯示，在對芝麻糊中大豆過敏原的檢測中，夾心ELISA方法和競爭ELISA方法都檢測到了微量大豆過敏原的存在，但是在芝麻糊食品標簽上沒有標注大豆過敏原成分，這可能是由于在食品的生產(chǎn)環(huán)節(jié)造成了交叉污染導致的。在餅干當中均未檢測到大豆過敏原成分，這與標簽和配料表上描述的一致，在對醬油和黃豆醬的檢測中，競爭ELISA方法比夾心ELISA方法檢測到的大豆過敏原含量要略高一些，這可能也是因為黃豆醬和醬油都屬于發(fā)酵類食品，發(fā)酵對食物中的蛋白有影響，會導致某些蛋白過敏原性的降低，或者大分子蛋白的降解，或者對過敏原的表位造成破壞，進而導致夾心ELISA方法無法完全準確地測出其中所含過敏原的含量[24]。在對豆奶中大豆過敏原的檢測中，夾心ELISA方法要比競爭ELISA方法的靈敏度和準確性更好一些，這與之前的研究結果是一致的，對于成分簡單，輕加工的食品來說，更適用于夾心ELISA方法進行大豆過敏原的檢測，而對于深度加工，加工條件比較劇烈的食品來說，更適用于競爭ELISA方法來檢測其中大豆過敏原的含量。

3 討論

本研究初步建立了檢測大豆過敏原的雙抗夾心ELISA方法和競爭ELISA方法，通過實際加工樣品的回收實驗、加標食品回收實驗以及對真實食物樣本的檢測，對競爭ELISA法和雙抗夾心ELISA法的適用范圍進行了比較，結果表明，競爭ELISA法更適用于食物基質(zhì)復雜，經(jīng)過深度加工的食品，而夾心ELISA法更適用于食物成分簡單，輕加工后的食品，兩種方法沒有優(yōu)劣之分，在各自的適用范圍內(nèi)均能實現(xiàn)較準確的檢測。

在進行回收率的實驗中，發(fā)現(xiàn)有基質(zhì)效應的存在，越是復雜的食物體系，回收率會越低，可能是因為食品基質(zhì)的復雜組分之間會產(chǎn)生相互作用來影響過敏原的檢測，并且基質(zhì)組分和加工時的相互作用等因素可能會加大對過敏原檢測的影響[25-26]。所以在以后可增強對食品基質(zhì)效應的影響以及食品加工對食物致敏性影響的研究。

綜上，本研究初步建立了大豆過敏原的兩種ELISA檢測方法，并進行了比較。對之后食物樣品中大豆蛋白的快速檢測和篩選有積極的作用，使得可以通過檢測盡可能低量的過敏原來最大程度的降低過敏反應的風險，具有一定的應用前景和應用價值。