低共熔溶劑分離油茶果殼木質素及其抗氧化活性和熱解特性分析

李 鋒，李逸青，毛海立，黃德娜，曾承露,

（1.黔南民族師范學院化學化工學院，貴州都勻 558000；2.黔南環境治理與污染控制工程研究中心，貴州都勻 558000）

油茶是我國南方廣泛種植的木本食用油料樹種，種植面積約6000萬畝，每年油茶加工產生的果殼副產物可達約400萬噸[1]。大部分油茶果殼以焚燒或丟棄方式處理，造成資源浪費和環境污染。因此，如何將油茶果殼轉化為高附加值資源成為當今的研究熱點。油茶果殼組分復雜多樣，其中纖維素（13.87%～20.95%）、半纖維素（35.15%～49.34%）和木質素（30.07%～36.23%）含量占比達到80%以上[2]。木質素是天然芳香族高分子聚合物，含有多種類型活性官能團，如羥基、羧基和甲氧基等，將其轉化為芳香族化學品、生物燃料和生物功能材料后在化工、醫藥、食品和能源等領域具有較廣的應用前景和科學研究意義[3]。

提取木質素常用的方法有堿法、酸法、酶法、有機溶劑法等[4-6]，不同處理分離得到的木質素結構存在較大差異。崔興凱等[7]利用五種不同方法提取甘蔗渣木質素并研究其結構及熱解特性，結果發現五種木質素分子量和熱解特性存在較大差異，其中乙酸木質素的酚羥基含量（3.19%）和重均分子量均高于Acetosolv木質素。Pin等[8]利用不同類型質子型離子液體提取甘蔗渣木質素對其化學結構分析，發現[Etid][Lac]型離子液體分離的木質素中β-O-4鍵可達48.2%，而[2He][Lac]型離子液體分離的木質素中β-O-4鍵僅為19.3%。Wei等[9]采用有機溶劑法和球磨法提取桉樹木質素，結果表明球磨法提取磨木木質素中β-O-4、β-β、β-5和β-1的比例分別為52.19%、15.38%、5.13%和1.44%，而有機溶劑法提取木質素中四種化學鍵相對較少，分別為7.74%、5.71%和0.82%，且不含β-1鍵；此外，球磨法提取磨木木質素中甲氧基含量比有機溶劑法提取木質素含量高，但其羥基含量比有機溶劑提取木質素含量低；通過進一步的木質素抗氧化活性試驗發現有機溶劑分離得到的木質素明顯高于磨木木質素。綜上所述，由于木質素提取方法不同，導致其結構和抗氧化活性存在較大差異。

近年來，低共熔溶劑（Deep eutectic solvents，DES）因具有良好水溶性、可降解性、生物相容性、高選擇性、可回收利用、高效率和易制備等優點，已成為有機溶劑和離子液體的替代品，并已應用于提取分離木質素[10]。本研究以傳統堿法提取木質素作為參考，探究羧酸型、醇型和三元體系膽堿類低共熔溶劑分離的油茶果殼木質素在分子結構、熱穩定性和抗氧化活性方面存在的差異。以期為油茶加工廢棄物資源高值化利用及開發木質素基抗氧化性功能材料提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油茶果殼 產自貴州省荔波縣；無水乙醇、冰乙酸、氫氧化鈉、濃硫酸、吡啶、醋酸酐、石油醚、1,4-二氧六環、乙醚、對甲苯磺酸、草酸、丙三醇、氯化膽堿等 均為分析純；1,1-二苯基-2-苦基肼（DPPH，純度96%） 上海麥克林生化科技有限公司；四氫呋喃（色譜級） 國藥化學試劑有限公司。

GreatWall HWCL-3集熱恒溫磁力攪拌油浴鍋

鄭州長城科工貿有限公司；臺式冷凍高速離心機

上海盧湘儀離心機有限公司；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析儀器有限公司；Nicolet iS20傅里葉變換紅外光譜儀 美國賽默飛世爾科有限公司；TDA/DSC 2熱重/差熱同步分析儀瑞士梅特勒-托利多儀器公司；waters1525/waters 2414液相色譜-凝膠滲透色譜儀 美國沃世特科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DES的合成 DES合成方法參考文獻[10]中描述方法并做適當修改。氯化膽堿（ChCl）作為氫鍵受體和氫鍵供體（草酸、丙三醇、乙二醇和對苯甲磺酸）按不同摩爾比例混合后，置于80 ℃恒溫的油浴鍋中反應2 h，使其充分混合成為透明均一液體，分別得到以下三種低共熔溶劑：氯化膽堿-草酸（摩爾比1:1，ChCl-OA）、氯化膽堿-丙三醇（摩爾比1:2，ChCl-GA）和氯化膽堿-乙二醇-對甲苯磺酸（摩爾比1:1.96:0.06，ChCl-EG-P），取出冷卻后密封保存，備用。

1.2.2 不同方法制備木質素 油茶果殼自然風干，粉碎后過80目標準篩，取篩下物，將一定量粉末置于索式抽提器中，加入一定體積的苯和乙醇混合溶液（2:1，v/v）抽提6 h，脫除色素、脂肪和蠟等雜質，抽提完成后過濾去除苯和乙醇溶液，剩余固體自然風干，收集備用。

堿法提取木質素工藝參考文獻[7]中所述方法并適當修改。油茶果殼粉末與3% NaOH溶液在固液比（w/v，下同）為1:10條件下充分混合后，置于90 ℃油浴鍋中，攪拌速度200 r/min，反應90 min，過濾得到澄清黑液，逐滴加入質量分數為4%硫酸溶液至黑液中，溶液pH調節至2.0左右，使木質素沉淀析出，在轉速10000 r/min條件下離心10 min，棄上清液，固體沉淀用去離子水洗至中性后，用90%的1,4-二氧六環水溶液（V二氧六環:V水=1:9）溶解固體沉淀，轉速為9000 r/min，離心10 min除去不溶物，上清液減壓濃縮后，加入10倍體積的去離子水，木質素固體析出，轉速為9000 r/min，離心10 min除上清液，收集固體，放置于冷凍干燥機12 h后，得到干燥堿木質素，標記為AL。

DES法提取木質素過程參考文獻[10]所述方法并適當修改。油茶果殼粉末分別與氯化膽堿-草酸（ChCl-OA）、氯化膽堿-丙三醇（ChCl-GA）、氯化膽堿-乙二醇-對甲苯磺酸（ChCl-EG-P）三種DES混合均勻后（固液比1:20），置于120 ℃油浴鍋中，攪拌速度200 r/min，反應6 h后，冷卻后離心得到透明液體，殘渣用無水乙醇洗滌3～5次，合并過濾液體，旋蒸去除無水乙醇，將濃縮液緩慢加入4 L去離子水中，使木質素固體沉淀析出，過濾收集固體沉淀。用無水乙醇多次洗滌固體沉淀，確保無DES殘留后，將過濾分離得到固體沉淀進行冷凍干燥12 h，得到干燥粗木質素，氯化膽堿-草酸、氯化膽堿-丙三醇、氯化膽堿-乙二醇-對甲苯磺酸三種DES分離所得木質素分別標記為：ChCl-OA、ChCl-GA和ChCl-EG-P。

以上粗木質素純化按照崔興凱等[7]描述方法，將粗木質素溶于90%乙酸水溶液，然后加入10倍體積的去離子水，析出木質素沉淀，過濾，木質素水洗至中性后冷凍干燥。再將干燥的木質素溶于1,4-二氧六環-乙醇溶液（V1,4-二氧六環:V乙醇=8:2），轉速為9000 r/min，離心10 min去除不溶物，澄清液中滴加5倍體積的乙醚-石油醚溶液（V乙醚:V石油醚=1:1），使木質素沉淀析出，所得木質素采用乙醚-石油醚溶液洗滌兩次后，冷凍干燥。

1.2.3 木質素結構表征

1.2.3.1 紫外光譜分析 將2 mg木質素分別溶解于20 mL氫氧化鈉溶液（pH12）和20 mL 1,4-二氧六環水溶液（V1,4-二氧六環:V水=1:9）后，利用紫外分光光度計在波長范圍為200～400 nm內，進行光譜掃描。

1.2.3.2 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分析 取1 mg干燥純化的木質素與100 mg光譜純溴化鉀在瑪瑙研缽中充分研磨至粒徑小于2 μm左右，利用壓片機進行制樣，獲得厚度均勻透明的薄片，采用傅里葉變換紅外光譜儀進行圖譜掃描，范圍為500～4000 cm-1，分辨率4 cm-1。

1.2.3.3 凝膠滲透色譜分析 按照劉金科等[11]描述的方法對木質素進行乙?；Ｈ?0 mg木質素溶于4 mL吡啶/醋酸酐（體積比為1:1）混合液，在避光條件下常溫攪拌24 h后，將木質素溶液逐滴加入乙醚溶液中，沉淀出乙?；举|素，過濾得到木質素沉淀，用乙醚洗滌沉淀直至無吡啶殘留后，置于40 ℃真空干燥箱中干燥。取2 mg乙酰化木質素完全溶于1 mL四氫呋喃（THF）后，用有機系濾頭過濾木質素溶液，取10 μL木質素溶液進樣，采用凝滲透色譜儀測定木質素相對分子量。色譜條件：色譜柱Agilent PLgel 5 μm MIXED-C，柱溫35 ℃，流動相四氫呋喃，流速1 mL/min，以不同分子量聚苯乙烯作為標準品測得其相對分子量后，繪制標準曲線。

1.2.3.4 熱重分析 木質素熱解特性采用熱重/差熱同步分析儀進行測試，測定溫度范圍：30～1000 ℃，升溫速率：20 ℃/min。以高純氮氣（99.999%）為載氣，氣體流速：10 mL/min。

1.2.4 木質素清除DPPH自由基能力測定 將不同質量木質素溶于1,4-二氧六環/水（體積比為9:1）溶液中，制得0.2～1.0 mg/mL的木質素溶液，取0.1 mL的木質素溶液置于10 mL棕色離心管中，加入3.9 mL DPPH的乙醇溶液（濃度為25 mg/L），搖勻后，放置于25 ℃的水浴鍋中，靜置30 min后，利用紫外分光光度計在波長517 nm處測量溶液吸光度。根據以下公式計算DPPH自由基清除率：

式中：A0為空白實驗組吸光度；Ai為待測樣品吸光度。

1.3 數據處理

所有實驗均進行三次重復，實驗數據采用平均值±標準差表示，并采用Origin 2021軟件進行數據分析和作圖。

2 結果與分析

2.1 紫外吸收光譜分析

木質素具有苯環結構和共軛羰基等基團，因此會有明顯的紫外吸收性能。圖1為四種木質素分別在氫氧化鈉溶液（pH12）和90% 1,4-二氧六環溶液中的紫外吸收光譜圖。在氫氧化鈉溶液中，四種木質素在210 nm（共軛烯鍵）、250 nm（共軛雙鍵的π-π*躍遷產生的K吸收帶）、和290 nm附近有明顯的吸收峰[12]。在1,4-二氧六環溶液中，AL、ChCl-EG-P和ChCl-OA僅在240和280 nm處出現吸收峰，而210 nm處未出現吸收峰。通常木質素特征峰在280 nm處（苯環的吸收帶），但油茶果殼木質素在氫氧化鈉溶液中290 nm處出現吸收峰，可能是由于苯環的取代基不同，導致苯環上的π電子云密度降低，并且堿性溶液會使木質素中的酚羥基解離，從而導致最大吸收波長發生一定程度的位移[13]。此外，ChCl-GA在240～330 nm之間存在較寬吸收峰，可能是由于木質素中官能團互相導致出現特征吸收峰疊加現象，此峰型與曾誠等[14]已報道的甘蔗渣磨木木質素類似。

圖1 油茶果殼木質素樣品的紫外光譜圖Fig.1 UV spectrum of lignin samples isolated from Camellia oleifera shell

2.2 油茶果殼木質素相對分子量

油茶果殼木質素分子量大小受限于提取工藝，且會直接影響木質素物化性質。為了解四種油茶果殼木質素的相對分子量和分布均勻性，采用凝膠滲透色譜測量木質素樣品的數均分子量（Mn）、重均分子量（Mw）和分散度（PDI），結果如表1所示。四種木質素分子量存在較大差異，AL的Mw為41858 g/mol，可能是氫氧化鈉溶液提取的木質素結構中保留了大量的芳醚鍵（β-O-4），使AL具有較高的相對分子量。Pin等[15]利用[Etid][Lac]和[Etid][Ac]兩種離子液體提取甘蔗渣的木質素分子量分別可達50010和31447 g/mol。然而，利用低共熔溶劑分離的三種木質素分別為10870、3451和2418 g/mol，這是由于低共熔溶劑可以解聚木質素分子結構中的芳醚鍵等化學鍵[16]，使其降解為小分子物質溶出。此外，堿木質素的分散度較大（PDI：4.53），表明其分子量分布較廣，而低共熔溶劑提取木質素的分散度均小于2，表明此類方法得到的木質素結構的均一性更高，其中利用三元低共熔溶劑體系（ChCl-乙二醇-對甲苯磺酸）提取的木質素分散度最?。≒DI：1.37）。在木質素高值化精煉過程中，低分散度的木質素具有更好的生物化學穩定性。

表1 油茶果殼木質素重均分子量（Mw）及其分散度（PDI：Mw/Mn）Table 1 Average molecular weights (Mw) and polydispersity indexes (PDI: Mw/Mn) of lignin isolated from Camellia oleifera shell

2.3 油茶果殼木質素紅外光譜分析

FTIR光譜圖能夠直觀反應木質素的特征化學結構和功能基團，圖2為4種木質素的紅外吸收光譜圖，參考已報道文獻[17-19]列出了木質素分子結構的特征基團對應紅外光譜吸收峰歸屬，見表2。四種木質素光譜圖相似度較高，表明它們的化學結構和官能團組成較相似，由于官能團含量存在差異，導致特征吸收峰的強度差別較大。為比較不同方法提取木質素官能團的相對含量，以1518～1505 cm-1處的吸收峰（木質素的特征吸收峰，歸屬于芳香族苯環骨架振動）作為參比[13]。四種木質素均在3400、2950和2845 cm-1附近存在吸收峰，表明木質素結構中存在羥基、甲基、亞甲基和甲氧基。木質素中代表羥基特征峰（約3400 cm-1附近）與木質素特征峰（1518～1505 cm-1處的吸收峰）的吸收強度比值（I3400/I1518-1505），可以反映其羥基相對含量。AL、ChCl-GA、ChCl-OA和ChCl-EG-P的特征峰強度比值分別為0.76、0.83、1.08和0.75，ChCl-OA吸收峰強度比值較高，表明其含有羥基含量高于其他三種木質素。

圖2 不同溶劑提取的油茶果殼木質素紅外光譜圖Fig.2 FTIR spectra of lignin samples from Camellia oleifera shell extracted with different solvents

表2 油茶果殼木質素紅外光譜吸收峰歸屬Table 2 Assigment of FTIR spectra of lignin isolated from Camellia oleifera shell

低共熔溶劑提取的三種木質素在1730～1700 cm-1之間存在吸收峰，其歸屬于非共軛的酮、羰基或酯基的C=O伸縮振動，而堿木質素中不存在此吸收峰，表明低共熔溶劑在提取木質素過程中破壞了部分苯環結構并生成醌型結構[13]。四種木質素均在1610～1590、1518～1505和1430～1420 cm-1處存在較強吸收峰（歸屬于苯環骨架特征），這是木質素結構的特征峰，說明木質素提取過程中苯環骨架結構保留完好。此外，在1330～1320、1230～1215和1125 cm-1附近存在吸收峰歸屬于紫丁香基單元結構（S型），1280～1260 cm-1處吸收峰為愈創木酚基環（G型）和C=O伸縮振動，表明油茶果殼木質素屬于典型的G-S型木質素。不同溶劑提取的油茶木質素中G/S相對含量，可以通過I1280-1260/I1330-1320比值大小來反映。AL、ChCl-GA、ChCl-OA和ChCl-EG-P中G/S相對比值分別為0.79、1.16、0.81和0.89，僅有ChCl-GA木質素比值大于1，說明此類木質素中愈創木酚基結構的相對含量比紫丁香基結構多[20]。綜上所述，四種油茶果殼木質素主要由愈創木酚基和紫丁香基單元結構組成，在紅外指紋區（1800～800 cm-1）出現的吸收峰均為木質素典型的紅外吸收峰，證實了堿法和DES法能夠較好保留油茶果殼木質素的完整性，但四種木質素中羥基含量、愈創木酚基和紫丁香基單元結構的含量存在明顯差異。

2.4 油茶果殼木質素熱穩定性評價

木質素是以苯丙烷單元結構為主體，由多種化學鍵連接而成的高分子有機化合物，化學鍵和官能團的類型及數量會直接影響其熱解特性，可以通過該熱解特性來評價不同方法提取的木質素化學結構中存在的差異。在升溫速率為20 ℃/min，油茶果殼木質素從室溫至1000 ℃的熱失重曲線大致可分為三個階段，如圖3所示，四種木質素的熱失重曲線存在較大差異。第一階段為30～120 ℃之間，主要為木質素中的自由水和結合水的揮發，四種木質素失重率均未超過10%。第二階段為200～400 ℃，四種木質素分解速率加速，失重率在24%～40%之間；此階段木質素的熱降解主要涉及化學鍵斷裂，如C-O鍵和C-C鍵，以及側鏈氧化，如羰基化、羧基化或脫氫反應等[21]。四種木質素在失重率和熱分解速率上存在較大差異，表明木質素含有的β-O-4鍵、C-C鍵的含量及化學官能團類型和數量不同，其中ChCl-GA的失重最明顯，說明其熱穩定性較差。第三階段為400 ℃以上，此階段主要是木質素骨架結構苯環的C-C鍵裂解和脫甲氧基[22]，所有木質素均呈現緩慢失重現象，700 ℃以后，木質素失重速率呈緩慢下降趨勢，逐漸趨于平緩。溫度升至1000 ℃時，ChCl-OA、ChCl-EG-P、AL和ChCl-GA的碳殘渣分別為43.23%、39.67%、36.53%和32.43%。

圖3 油茶果殼木質素樣品的TG和DTG曲線Fig.3 TG and DTG curves of lignin samples isolated from Camellia oleifera shell

此外，由DTG曲線可知，四種木質素的最大失重溫度和失重峰峰型存在較大不同，ChCl-OA、AL、ChCl-EG-P和ChCl-GA的失重速率達到最大時的溫度分別為391、362、304和283.3 ℃，最大失重速率依次為ChCl-EG-P＞ChCl-GA＞AL＞ChCl-OA。綜上所述，四種木質素的最大失重溫度、熱解失重速率和碳殘渣存在明顯差異，是由于四種木質素結構中化學鍵、官能團的種類和含量不同所導致。油茶果殼木質素的熱穩定性依次為：ChCl-OA＞AL＞ChCl-EGP＞ChCl-GA，由于四種木質素的熱穩定性存在差異，導致其后期研究應用也不同，比如ChCl-OA因其較好的熱穩定性，更適合制備生物碳基高分子聚合材料。

2.5 油茶果殼木質素抗氧化活性

木質素中含有大量酚羥基，具備作為天然抗氧化劑的潛力。由圖4可知，隨著木質素濃度增加，四種木質素的DPPH自由基清除能力均逐漸增加，呈現出明顯的濃度依賴關系。不同溶劑提取的木質素對DPPH自由基的清除能力存在較大差別，可能是由于木質素結構中酚羥基含量不同所導致的[23]。此外，當木質素濃度超過1.0 mg/mL時，AL、ChCl-OA和ChCl-EG-P的DPPH自由基清除率增長趨勢放緩，維持在80%～87%之間，而ChCl-OA的DPPH自由基清除率呈現明顯增加趨勢。當木質素濃度為1.5 mg/mL時，AL、ChCl-OA、ChCl-EG-P和ChCl-GA的DPPH自由基清除率分別可達86.64%、83.87、86.67%和77.19%。IC50是自由基清除率達到50%時所需樣品的質量濃度，其倒數為自由基清除指數（radical scavenging index，RSI），常作為抗氧化能力的評價，該值越大表明抗氧化活性越強[24]。經數據擬合計算得出AL、ChCl-OA、ChCl-EG-P和ChCl-GA

圖4 四種木質素清除DPPH自由基能力比較Fig.4 Comparison of DPPH radical scavenging activity of four lignin samples

的IC50分別為0.388、0.641、0.475和1.02 mg/mL，RSI依次分別為2.57、1.56、2.1和0.98，此結果表明堿木質素對DPPH自由基的清除能力大于低共熔溶劑法分離的木質素。李晗等[25]提取的油茶果殼乙酸木質素和堿木質素對DPPH自由基清除清除率分別為81.06%和73.36%。朱夢妮等[26]分析了堿法提取核桃殼、稻殼、玉米秸稈和蘆葦木質素的抗氧化活性，當木質素濃度為0.4 mg/mL時，DPPH自由基的清除率在14.9%～53.5%之間。與已報道的研究相比，油茶果殼木質素表現出較好的DPPH自由基清除能力，表明油茶果殼木質素在食品、醫藥、包裝等生物活性材料領域具有較好應用潛力。

3 結論

本研究以油茶果殼為原料分別利用堿法和低共熔溶劑法提取分離得到四種木質素，并對其化學結構和潛在生物活性進行了評價。紫外和紅外光譜圖表明堿法和低共熔溶劑法提取分離木質素較完整保留了油茶果殼中原始木質素結構，屬于典型G/S型木質素，由紅外光譜特征吸收峰強度比值可知，ChCl-OA中羥基含量較多，ChCl-GA中愈創木酚基單元結構的相對含量高于紫丁香基單元結構。堿法提取油茶果殼木質素的相對分子量和分散度較大，而低共熔溶劑提取木質素分子量和分散度相對較低，表明低共熔溶劑分離的木質素結構均一性更好。從熱重分析可知，與其他三種木質素相比，ChCl-GA熱分解溫度較低和熱失重速率較高，表明其熱穩定性較差；四種木質素熱穩定性依次為：ChCl-OA＞AL＞ChCl-EGP＞ChCl-GA。此外，由DPPH自由基清除能力評價可知，當木質素濃度高于0.8 mg/mL后，AL、ChCl-EG-P和ChCl-OA對DPPH自由基清除率較相近，表現出具有較好抗氧化活性的潛力。

本研究利用低共熔溶劑高選擇性木質素溶解體系，分離提取油茶果殼木質素，得到的木質素分子量分布較窄且生物活性較好，解決了傳統化學試劑（如堿法）提取的木質素存在的勻質性差的問題，為開發清潔的木質素分離技術提供借鑒。本研究尚未完全闡明不同低共熔溶劑提取的木質素分子結構中存在的顯著差異，如木質素中β-O-4、β-β、β-5、β-1等化學鍵和官能團（甲基、甲氧基和酚羥基等）所占比例等方面存在的差異。未來研究應著重以下兩方面：a.對分離所得木質素結構進行全面解析，如利用核磁共振技術深入研究分離過程中木質素結構（主要化學鍵和官能團）的變化與潛在的抗氧化活性之間的關系；b.開發新穎低共熔溶劑體系，在分離過程中盡可能保護木質素的原始結構，尤其是β-O-4的保護。