基于體外發酵研究仙人掌果實花色苷對腸道菌群及代謝物SCFAs的影響

邵 帥，趙 晶，張 嵐，王瑞雪，張 筠, ，初 眾

（1.黑龍江東方學院食品工程學院，黑龍江哈爾濱 150066；2.中國熱帶農業科學院香料飲料研究所，海南萬寧 571533）

仙人掌果（Opuntia ficus-indica）是仙人掌屬（Opuntia）植物的果實，源自美洲大陸的一種多漿植物，廣泛分布于南非，該植物主產于我國熱帶地區，例如海南、云南、廣西，具有氣候耐受性。仙人掌果具有較高的營養價值，但是其鮮銷和保存都比較困難，所以為了最大限度利用仙人掌果，提取其生物活性物質進行產品化利于保存與運輸。仙人掌果中存在大量的生物活性物質如花色苷、多糖類、蛋白質等。花色苷在漿果中含量最為豐富，它是花色素與糖以糖苷鍵結合而成，屬于類黃酮類化合物，是天然水溶性物質[1]。

近年來花色苷通過調節腸道微生物從而促進人體健康已成為研究熱點[2]。花色苷在攝入后經歷復雜的代謝，未被消化的花色苷和花色苷的分解代謝產物到達結腸對腸道微生物進行作用[3]。花色苷對腸道微生物的調節作用表現在兩方面，一是腸道菌群通過代謝活動，使其具有直接的生理活性功能（例如調節糖尿病、肥胖癥）[4]，二是改變了腸道微生物的數量與構成，對人體發揮健康促進作用[5]，對此研究者們進行大量研究。Wu等[6]研究發現，從桑葚中提取得到的花色苷能夠顯著抑制高脂膳食誘導引起的C578BL/6小鼠體重的增加并同時降低痩素和脂聯素分泌以及胰島素抵抗。Norberto等[7]通過對比研究發現，習慣性攝入藍莓花色苷會減少二型糖尿病的發作把血糖控制在安全的水平。Gowd等[8]通過建立體外消化模型模擬口腔、胃-腸道消化來研究花色苷的消化吸收的程度，結果表明花色苷與腸道細菌相互作用使其呈現出劑量梯度。Walujkar等[9]研究了潰瘍性結腸炎患者腸道菌群的變化，發現潰瘍性結腸炎患者腸道存在生態失調和專性厭氧菌失調。

迄今為止，花色苷的生物利用度和健康益處已被廣泛記載[10]，但是由于目前研究者們普便利用藍莓、藍靛果、紫馬鈴薯等研究花色苷，而利用仙人掌果少之又少，對于仙人掌果中花色苷的研究還不夠完全和深入[11]，所以為了進一步預估仙人掌果花色苷在人體中發生的潛在作用，本文以仙人掌果果實為原料，從中提取花色苷進行模擬體外消化實驗和體外發酵實驗。通過pH示差法，評價消化過程中仙人掌果花色苷的消化率，Novaseq 6000測序和氣相色譜（GC）分析腸道菌群以及短鏈脂肪酸的變化，為仙人掌果果實中花色苷作為膳食補充劑調節人體健康提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

無水乙醇、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、碳酸氫鈉、七水合硫酸鎂、六水合氯化鈣、吐溫80、硫酸、乙醚、氯化鉀、氯化鈉、六水合氯化鎂、碳酸銨、濃鹽酸、氫氧化鈉 分析純，天津市光復科技發展有限公司；蛋白胨、酵母膏、豬膽鹽 分析純，北京奧博星生物技術有限公司；氯化血紅素、維生素K1、L-半胱氨酸、α-淀粉酶（4000 U/g）、胃蛋白酶（250 U/mg）、胰蛋白酶（3000 U/mg） 分析純，上海源葉生物科技有限公司；6種水溶性脂肪酸混標 色譜純，壇墨質檢科技股份有限公司；糞便DNA試劑盒 型號D3141，廣州美基生物科技有限公司；仙人掌果 購買于海南；糞便樣品 來源于2位健康的志愿者，過去三個月內沒有消化系統疾病、沒有使用任何的抗生素和益生菌（18～30歲、1位女士和1位男士），實驗前已經和志愿者闡述利害關系，試驗均在志愿者同意下進行。

Magnetic stirrer磁力攪拌器 意大利Velp公司；Allegra 64R Compact Centrifuge離心機 貝克曼庫爾特公司；UV1800紫外可見分光光度計 上海棱光技術有限公司；RE-25AA旋轉蒸發儀 上海亞榮生化有限公司；FDU-1100真空冷凍干燥機 日本東京理化儀器有限公司；BSD-TX345搖床 上海啟閔生物技術有限公司；7890A氣相色譜 安捷倫科技有限公司；Vortex.Genie2漩渦振蕩 上海邁旗環保科技有限公司；Bactron Ⅱ厭氧培養箱 美國Shellab公司；ABI StepOnePlus RealTime PCR System Life Technologies 美國ABI。

1.2 實驗方法

1.2.1 仙人掌果花色苷提取物的制備 準確稱取一定質量過40目篩的原料粉末，用51%的乙醇溶液（pH2）進行提取，料液比為1:25 g/mL，于55 ℃磁力攪拌提取70 min。4500 r/min，15 min離心，取上清液于50 ℃減壓濃縮得到花色苷溶液，凍干成粉末[12]。

1.2.2 體外消化模型的建立 以Minekus等[13]的方法為基礎稍做調整，制備模擬唾液（SSF）、模擬胃液（SGF）和模擬腸液（SIF）電解質儲備溶液，如表1。

表1 消化電解質液原液的配制Table 1 Configuration of digestive juice

模擬口腔消化：取10 mg/mL的仙人掌果花色苷粗提物5 mL，依次加入3.5 mL SSF電解質液、25 μL CaCl2·2H2O、0.5 mL活力值為1200 U/mL的α-淀粉酶，最后用超純水定容至10 mL。在恒溫搖床37 ℃、120 r/min、避光進行2 min。消化完成后立即轉入-80 ℃冰箱滅酶。

體外模擬胃消化：將口腔消化產物（10 mL）加入7.5 mL SGF電解質液、1.6 mL活力值為24000 U/mL的胃蛋白酶、5 μL CaCl2·2H2O溶液，用HCl調pH為3后，加超純水至20 mL。對照組：僅將模擬未消化中1.6 mL胃蛋白酶使用SGF電解質液等量代替。在恒溫搖床37 ℃、120 r/min、避光進行胃消化，分別在1、2、3 h，取消化產物于-80 ℃冰箱滅酶。

體外模擬腸消化：將胃消化產物（20 mL）中加入11 mL SIF電解液、5 mL活力值為1000 U/mL的胰蛋白酶、4%豬膽鹽2.5 mL、40 μL 0.3 mol/L CaCl2·2H2O溶液，用NaOH調pH為7后，加超純水至40 mL。對照組：僅將模擬腸消化中腸蛋白酶和豬膽鹽用7.5 mL SIF電解液代替。在恒溫搖床37 ℃、120 r/min避光進行腸消化，分別在1、2、3 h，取腸消化產物于-80 ℃冰箱滅酶[14-17]。

1.2.3 模擬體外消化過程中花色苷含量和消化率的測定 采用pH示差法對消化過程中仙人掌果花色苷含量變化的測定，取兩份2.0 mL的仙人掌果花色苷溶液，分別用0.025 mol/L，pH1.0氯化鉀緩沖液和0.4 mol/L，pH4.5醋酸鈉緩沖液定容至25 mL的容量瓶中。靜置60 min，分別在535和700 nm下測定吸光值，根據公式，計算出花色苷的含量[18]，公式如下：

式中：W為花色苷的含量，mg/g；Mw為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾質量，449.2 g/moL；A為花色苷吸光度，A=（A535pH1.0-A700pH1.0）-（A535pH4.5-A700pH4.5）；DF為稀釋倍數；V為定容的體積，mL；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數，26900 L/（mol·cm）；L為比色皿的寬度（1 cm）；M為樣品質量，g。

消化率的計算公式如下：

1.2.4 仙人掌果實花色苷體外發酵實驗 基礎厭氧培養基配制[19]：酵母提取物（2.0 g）、蛋白胨（2.0 g）、NaHCO3（2.0 g）、膽汁鹽（0.5 g）、L-半胱氨酸（0.5 g）、NaCl（0.1 g）、K2HPO4（0.04 g）、KH2PO4（0.04 g）、氯化血紅素（0.02 g）、MgSO4·7H2O（0.01 g）、CaCl2（0.01 g）、維生素K1（10 μL）、吐溫80（2.0 mL）溶于1.0 mL蒸餾水，將基礎營養培養基的pH調節至7.0，121 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

磷酸鹽緩沖液（PBS）配制：氯化鈉（2.0 g）、磷酸二氫鉀（0.2 g）、磷酸氫二鈉（2.9 g）、氯化鉀（0.2 g），溶于1 L超純水中，滅菌冷卻調節pH7.4，于4 ℃冷藏備用。

試驗當天取健康成年人（1男1女）（身體健康，無胃腸道疾病且近三個月未服用過抗生素）糞便，將收集好的糞便樣品轉入厭氧培養箱進行處理，在電子天平上稱取糞便樣品各10 g，與磷酸鹽緩沖溶液以1:10（w/v）的比例混勻（采用一男一女得到更豐富的菌群，以構建腸道菌群模型），紗布過濾備用。在三角瓶中加入27 mL厭氧培養基，3 mL過濾的糞便懸濁液，1 mL不同濃度的花色苷溶液分為L組（低劑量5 mg/mL）、M組（中劑量10 mg/mL）、H組（高劑量15 mg/mL），K組（空白）使用等量無菌水代替花色苷溶液。于37 ℃恒溫厭氧培養箱中培養24 h[19-20]。

1.2.5 氣相色譜檢測體外發酵后短鏈脂肪酸含量前處理：將發酵24 h后的樣品在條件為12000 r/min、4 ℃、5 min下離心，沉淀于冰箱保存備用。取上清液5 mL依次加入0.5 mL 50%的硫酸溶液以及5 mL乙醚，混勻旋渦振蕩2 min后，于4 ℃，10000 r/min，5 min下進行離心，取上層乙醚層，過0.22 μm有機相濾膜后存于氣相小瓶進行檢測[21]。

氣相色譜條件：色譜柱為10mDB-WAX毛細管柱，進樣口溫度為220 ℃，分流比為10:1，柱流量為1.5 mL/min，氮氣橫流，程序升溫第一階段為70 ℃，1 min；第二階段以15 ℃/min升至160 ℃，6 min；第三階段以30 ℃/ min升至210 ℃保持5 min，采用氫火焰檢測器（FID）檢測器溫度為250 ℃[20-21]。

1.2.6 菌群多樣性構成分析 K組、L組、M組以及H組共12例人類糞便與花色苷厭氧培養物樣品中腸道微生物總DNA提取以及高通量測序委托廣州基迪奧生物科技有限公司進行；采用糞便DNA試劑盒提取DNA；對目標片段16S rDNA V3～V4區域進行PCR擴增，以第一個引物中的barcode作為特異引物擴增得到目標產物；將目標片段中PCR擴增的產物經電泳檢測后，切膠回收目標片段，采用熒光定量PCR擴增產物；使用AMPure XP Beads對第二輪擴增產物進行純化，用ABI StepOnePlus RealTime PCR System（Life Technologies，產地美國）進行定量；根據Novaseq 6000的PE250模式pooling上機測序。

1.3 數據處理

采用SPSS 17.0軟件對數據進行統計分析（P＜0.05表示差異有統計學意義），Origin 2021進行作圖。高通量測序的原始數據進行質控、過濾、去嵌合體，得到的有效數據，進行分類操作單元的劃分以及系統發育學分析，菌群結構差異及差異微生物種類采用Usearch分析。

2 結果與分析

2.1 模擬消化過程對花色苷含量的變化

仙人掌果花色苷在模擬胃消化過程中含量的變化結果見圖1。經胃消化3 h后花色苷含量與初始量相比顯著下降（P＜0.05），其消化率為11.4%；模擬胃消化組與胃消化空白組相比，花色苷含量稍有降低，但不具有顯著性差異（P＞0.05）。由于胃消化空白組未添加胃蛋白酶，因此該結果表明花色苷在消化過程中不受胃蛋白酶的影響，但受胃酸和胃液的影響較大[22]。仙人掌果花色苷在模擬腸消化過程中含量的變化結果見圖2，經腸消化4 h后花色苷含量急劇下降（P＜0.05），其消化率為23.5%；模擬腸消化組與腸消化空白組相比，花色苷含量具有顯著性差異（P＜0.05）。腸消化空白組未添加胰蛋白酶和膽鹽，因此該結果表明花色苷在腸消化過程中受膽汁、胰蛋白酶的影響較大，花色苷在pH較高的腸液中不穩定，易被消化[22-23]。仙人掌果實花色苷經由胃-腸的總消化率為34.9%。絕大部分花色苷剩余，不會被上消化道消化[24]。

圖1 仙人掌果花色苷在模擬胃消化過程中含量的變化Fig.1 Changes of anthocyanins in Opuntia ficus-indica during simulated gastric digestion

圖2 仙人掌果花色苷在模擬腸消化過程中含量的變化Fig.2 Changes of anthocyanins in Opuntia ficus-indica during simulated intestinal digestion

2.2 氣相色譜檢測體外發酵后短鏈脂肪酸含量的變化

短鏈脂肪酸（Short chain fatty acids，SCFAs）是由腸道微生物在結腸內發酵未被消化的物質，包括碳水化合物、多糖低聚糖、膳食纖維以及其他植物營養素在腸道中獲得的碳原子數為1～6個的飽和脂肪酸[25]。由圖3可知與K組相比，H組、M組、L組總短鏈脂肪酸含量均顯著升高（P＜0.05），分別為K組的7.8、5.0和1.1倍。與K組相比，L組乙酸、丙酸和丁酸含量上具有顯著差異性（P＜0.05），分別上升1.1、1.3和1.2倍，異丁酸、異戊酸和戊酸含量無顯著性差異（P＞0.05）。與K組相比M組、H組均具有顯著差異性（P＜0.05），M組在乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸和戊酸的含量均明顯升高，分別為空白組的5.9、2.9、6.5、4.2、4.4和6.5倍；H組在乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、異戊酸和戊酸的含量均明顯升高，分別為K組的10.0、4.6、10.7、4.7、5.6和7.8倍。從圖3中還可知，仙人掌果實花色苷與人類糞便共培養后產生的乙酸、丙酸、丁酸其含量比較高。分析得出花色苷在一定程度上會影響短鏈脂肪酸的產生，擬桿菌門促進乙酸的產生，厚壁菌門促進丁酸的產生，放線菌門促進丙酸的產生[26]。隨著花色苷濃度的增加短鏈脂肪酸含量升高，可能是由于花色苷與腸道上的微生物進行相互作用[25-27]。

圖3 仙人掌果花色苷在厭氧發酵中短鏈脂肪酸的變化Fig.3 Changes of short-chain fatty acids in prickly pear anthocyanins during anaerobic fermentation

2.3 體外發酵仙人掌果實花色苷對腸道菌群的影響

2.3.1 菌群Alpha多樣性分析 Alpha多樣性與物種數目也就是均勻度以及生態系統內的多樣性兩個因素有關，描述群落均勻度的指標主要包括Chao1、ACE指數，指數越小，群落均勻度低，多樣性就越高；描述群落多樣性的指數有Shannon、Simpson指數，指數其值越高，表明群落多樣性越高。由表2所示，與K組相比L組、M組以及H組Chao1與ACE指數均顯著減少（P＜0.05），而Shannon指數與Simpson指數均顯著增加（P＜0.05）。使得腸道菌群內豐多樣性的升高，表明添加花色苷會改變腸道內的菌群的多樣性。

表2 花色苷對腸道微生物群α多樣性指數的影響Table 2 Effects of anthocyanins on the alpha diversity index of gut microbiota

2.3.2 菌群Beta多樣性分析 PCoA（principal coordinates analysis）是樣本間的差異分析。每一個點代表一個樣本，相同顏色的點來自同一個分組，兩點之間距離越近表明兩者的群落構成差異越小，距離越遠，差異比例越大。由圖4a可以得出，各個樣本之間完全分離，說明各個樣品中微生物菌落發生改變且差異明顯，表明此次結果能夠較好的描述樣本特征，M組與K組距離最遠，相似度最低，表明微生物群落相似度最低差異大，而L組與H組距離最近相似度最大，微生物群落相似度差異小。NMDS（Nonmetric multidimensional scaling）由圖4b可以得出應力函數值strees=0.00＜0.05表明具有很好的代表性。

圖4 仙人掌果實花色苷微生物菌群主坐標以及多維尺度分析Fig.4 Principal coordinates and multidimensional scale analysis of anthocyanin microbial flora in opuntia ficus-indica

2.4 仙人掌果實花色苷對腸道菌群物種組成的影響

2.4.1 物種組成分析 通過四組樣品每組三個樣本共12個樣品，這12個樣品的平均測序深度為128163±3388 reads，按照97%的相似性下每個樣本有476±33 OTUs，VENN圖表示樣品之間共有和差異物種或基因的情況，反映了各組之間共有的和特有的OTUs數目。根據圖5所示L組、M組以及H組共同擁有而K組未出現的為92個OTU。L組、M組、H組以及K組共有177個OTU。K組和L組、M組、H組獨特OTU分別為282、130、121、135。表明仙人掌果花色苷改變了糞便腸道微生物群的組成。

圖5 物種豐富VENN圖Fig.5 VENN diagram of species enrichment

2.4.2 門水平下物種組成分析 由圖6可知，各樣本的腸道微生物主要有厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）這5大門類[20-21]，占樣本豐富度的97%以上。其中K組變形菌門含量占比最多，添加仙人掌果實花色苷后L組、M組、H組分別顯著降低43.5%、44.0%、43.4%（P＜0.05），變形菌門包括絕大多數病原菌，如大腸桿菌、埃希氏菌、沙門氏菌、幽門螺旋桿菌、空腸彎曲桿菌[27]。與K組相比，L組、M組、H組的擬桿菌門增加43.5%、30.4%、28.1%，擬桿菌門促進乙酸以及異戊酸的產生，參與人體結腸中的代謝活動，通過代謝獲得碳源與能量，厚壁菌門促進丁酸的產生，加花色苷組丁酸含量增多與厚壁菌門占比增加有關[8]。如圖7所示，與K組相比，L組、M組以及H組厚壁菌門/擬干菌門（Firmicutes/Bacteroidetes，F/B值）的比例均顯著降低74.1%、35.1%、35.5%（P＜0.05），有利于減少肥胖的發生，高脂飲食、暴飲暴食會引起F/B值過高，該值越高表明發生肥胖的幾率就越高，被作為肥胖的有效生物標記物[28-31]。Wu等[25]利用黃秋葵多糖進行體外發酵，發現能夠降低變形菌門，增加擬桿菌門的豐富度，F/B值降低7.2%。Chen等[32]利用黑米花色苷，研究抑郁癥小鼠，發擬桿菌屬、厚壁菌門的水平增加，和變形菌門減少，其F/B值降低23.5%。由此可知，仙人掌果實中的花色苷的對腸道菌群的調節具有更好的作用。

圖6 仙人掌果實花色苷厭氧發酵下腸道菌群門水平相對豐度的變化Fig.6 Relative abundance of gut microflora phylum levels under anaerobic fermentation of anthocyanins from Opuntia ficus-indica

圖7 腸道菌群擬桿菌門/厚壁菌門的比例Fig.7 Ratio of Bacteroidetes/Firmicutes in the intestinal flora

2.4.3 屬水平下物種組成分析 由圖8可知，在仙人掌果實花色苷厭氧發酵下，K組主要有大腸桿菌志賀屬（Escherichia-Shigella）、鏈型桿菌屬（Catenibacterium）、脫硫弧菌屬（Desulfovibrio）占比較多。而在加入花色苷后，則以普氏菌屬（Prevotella）、光岡菌屬（Mitsuokella）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）為主。

圖8 仙人掌果實花色苷厭氧發酵下腸道菌群物種豐富熱圖Fig.8 Heat map of species enrichment of gut microbiota under anaerobic fermentation of anthocyanins from Opuntia ficus-indica

從圖9中可以得到，與K組相比，L組、M組以及H組大腸桿菌志賀屬占比顯著下降41.0%、41.2%、41.1%（P＜0.05），但L組、M組以及H組之間變化差異不大，大腸桿菌志賀屬中存在著很多已發現的病原體，會引起腸道炎癥等，對人體腸道菌群危害很大[33-34]。脫硫弧菌屬也被稱為硫酸鹽還原菌（SRB）屬于變形菌門。這類細菌可以“呼吸”硫酸鹽而不是氧氣。由于硫化氫（H2S）的產生，SRB被認為會對腸道上皮細胞具產生毒性，導致胃腸道疾病[35-36]，與K組相比，L組、M組以及H組脫硫弧菌占比顯著下降18.9%、19.6%以及19.9%（P＜0.05），花色苷可能通過破壞細菌細胞膜/細胞壁，促進其裂解死亡，從而抑制致病菌的生長。

圖9 仙人掌果實花色苷厭氧發酵下腸道菌群屬水平相對豐度的變化Fig.9 Relative abundance of gut microflora genus levels under anaerobic fermentation of anthocyanins from Opuntia ficus-indica

與K相比，L組、M組以及H組普氏菌屬占比顯著上升24.1%、40.7%、38.2%（P＜0.05），普氏菌屬存在于人類中，幫助分解蛋白質和碳水化合物食物，可以參與合成多種維生素，促進人體健康[26,37-38]。與K相比，L組、M組以及H組乳酸桿菌屬和雙歧桿菌屬的總含量增加（P＜0.05），分別增加了4.6%、5.8%、12.88%，L組、M組以及H組之間變化呈梯度增加，乳酸桿菌與雙歧桿菌作為公認的益生菌，可以使腸道微生物維持穩定狀態，乳酸桿菌屬可利用精氨酸生產L-鳥氨酸，促進腸粘膜形成，調節腸道粘膜穩態[39-42]。與K組相比，L組、M組以及H組光岡菌屬均增加，分別增加了36.0%、27.7%、27.2%（P＜0.05），而光岡菌屬豐富度的增加，能提高機體發酵碳水化合物、多糖的能力，對于減輕肥胖有很大益處[27,41]。

3 結論

仙人掌果實花色苷在在模擬體外消化過程中，經胃部少量消化,在腸中大量消化，經過胃-腸的消化率34.9%，最終65.1%到達大腸。表明大部分的仙人掌果實花色苷，不會被人體消化，可能抵達大腸被腸道菌群所利用。

在體外厭氧發酵24 h后，仙人掌果實花色苷促使乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸和戊酸六種短鏈脂肪酸含量顯著上升（P＜0.05），呈現劑量關系，其中仙人掌果實花色苷對乙酸、丙酸、丁酸的促進作用最為明顯。表明添加仙人掌果實花色苷能夠增加短鏈脂肪酸的產生，可能是使腸道菌群發生改變，從而促進了該短鏈脂肪酸產生菌的生長。

仙人掌果實花色苷干預可以改變腸道微生物群的多樣性和組成。在門水平上，主要是減少了變形菌門，增加了擬桿菌門、厚壁菌門以及放線菌門的增長。在屬水平上，增加了普氏菌屬、乳酸桿菌屬、雙歧桿菌屬、光岡菌屬等腸道有益菌的相對豐度，降低了大腸埃希菌和脫硫弧菌屬腸道有害菌的相對豐度。因此，仙人掌果實花色苷能夠調節腸道微生物的組成與多樣性，抑制有害菌，促進有益菌生長。仙人掌果實花色苷具有促進腸道健康的潛力，可以作為益生元進行探索。