金銀花黃酮提取物的降血糖作用

戴叢書，柴晶美，林長青

（延邊大學醫學院中醫系，吉林延吉 133000）

金銀花（Lonicera japonicaThunb.），有金銀藤、銀花、忍冬等別稱，是忍冬科忍冬屬多年生常綠植物。金銀花原產于東亞（包括中國、韓國和日本）[1]，現在新西蘭、澳大利亞、阿根廷、墨西哥、巴西和美國等許多國家均有種植。金銀花富含多種活性成分，如黃酮類、有機酸、揮發油、三萜皂苷類等[2-3]，眾多研究表明，金銀花具有解熱、抗炎、抗菌、抗病毒、免疫調節、抗氧化、護肝等生物學功能[4-8]。因此，金銀花被視為天然活性物質的重要來源。黃酮類化合物為金銀花的主要活性成分，研究表明，黃酮類化合物具有豐富的藥理活性，如抗菌、抗氧化、促進細胞代謝、增強機體免疫力等[9]。金銀花中目前鑒定出的黃酮類化合物包括木犀草素、忍冬苷等[10-11]。

糖尿病是一種代謝紊亂性疾病，影響著全球的數百萬人。若管理不當，可能導致危及生命的并發癥、器官衰竭和死亡。其中1型糖尿病（Type 1 Diabetes Mellitus，T1DM）是由于胰島β細胞完全或部分破壞而導致的一種慢性自身免疫性疾病。T1DM發病機制復雜，受遺傳、環境、免疫等諸多因素的影響[12-14]。臨床糖尿病物治療藥物主要包括胰島素促泌劑、胰島素增敏劑、雙胍類、胰島素及胰島素類似物等，均可發揮一定的降糖效果，促進血糖水平的控制[15]。已有研究表明，許多藥物可用于糖尿病的治療和預防，但它們長期使用會產生很多副作用[16]，因此，目前已轉向對藥用植物和草藥的研究。

目前有關金銀花黃酮的報道多集中在黃酮提取工藝的研究[17-18]，而對金銀花黃酮降血糖作用還鮮有報道。另外治療糖尿病的藥物還存在很多副作用，使得開發藥食同源的植物替代傳統藥物顯得尤為重要。因此，本文擬選用藥食同源的植物金銀花為對象，研究金銀花黃酮提取物的降血糖作用，旨在為糖尿病的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金銀花 延吉市海蘭江藥店；蘆丁 批號：Y16 M9S61523，上海源葉生物有限公司；C57BL/6小鼠

雄性，50只，體重（20±5）g，長春億斯試驗動物中心，合格證書：SCXK（吉）2018-0007，符合《延邊大學實驗動物倫理守則》，獲得延邊大學實驗動物倫理委員會批準；無水乙醇、亞硝酸鈉 分析純，天津市科密歐化學試劑有限公司；鏈脲佐菌素（STZ） 99.9%，批號：WXBC8740V，美國Sigma公司；鹽酸二甲雙胍片 95.0%，中美上海施貴寶制藥有限公司；TC、TG、HDL-C、LDL-C檢測試劑盒、SOD、CAT、GSH、MDA檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8 Elisa試劑盒、HE染色試劑盒北京索萊寶科技有限公司。

HH-4型四孔數顯恒溫水浴鍋 江蘇科析儀器有限公司；CCA-1111-CE型旋蒸冷凝器 東京理化器械株式會社；101A-1E型電熱鼓風干燥箱 上海安亭科學儀器有限公司；580型血糖儀 江蘇魚躍醫療設備股份有限公司；SuPerMax 3100型多功能酶標儀 上海閃譜生物科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 金銀花總黃酮提取 將金銀花烘干并粉碎過40目篩，參照田存章等[19]的方法并進行修改，取金銀花粉末200 g，按1:20（g:mL）的料液比加入75%乙醇溶液，50 ℃，超聲功率250 W，提取溫度50 ℃，超聲時間30 min，提取3次，過濾，合并提取液，減壓濃縮，按1:1的比例加入石油醚洗滌3次，乙酸乙酯萃取3次，減壓濃縮干燥，4 ℃保存備用。

1.2.2 總黃酮含量測定 將蘆丁標準品配制成0.2 mg/mL，分別取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL置于10 mL容量瓶中并定容，采用NaNO2-Al（NO3）-NaOH法[20]，測定溶液在510 nm處的吸光度，并繪制標準曲線。取金銀花黃酮提取物1 g溶于1 mL無水乙醇中，并定容至10 mL，將溶液稀釋100倍，使其吸光度在0.2～0.8范圍內，按照上述方法測定510 nm吸光度，按公式（1）計算樣品中總黃酮含量。

式中：F為總黃酮含量，mg/g；C為提取液中總黃酮質量濃度，mg/mL；d為稀釋倍數；V為提取液定容體積，mL；M為金銀花提取物質量，g。

1.2.3 試驗動物分組及給藥 小鼠在溫度25±2 ℃，濕度55%環境中適應性喂養1周，10只作為正常組，其余40只一次性腹腔注射STZ（130 mg/kg·BW）建立T1DM模型，72 h后，隔夜禁食不禁水，共禁食12 h，尾尖取血，棄掉第一滴血，用血糖儀進行測量，空腹血糖值≥11.1 mmol/L視為造模成功，并將造模成功小鼠其隨機分為模型組、金銀花黃酮提取物低劑量組（200 mg/kg）、金銀花黃酮提取物高劑量組（400 mg/kg）、陽性組（二甲雙胍200 mg/kg）[21]，每組10只，連續灌胃8周，正常組和模型組灌以等量蒸餾水，試驗期間每天測量小鼠體重，每兩周記錄所有小鼠的空腹血糖值（FBG）。

1.2.4 小鼠OGTT測定 實驗最后一天各組小鼠給予等量的葡萄糖溶液，灌胃后0、30、60、90 min分別測定各組小鼠血糖值[22]。

1.2.5 小鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C測定實驗最后一天，對小鼠采取心臟取血，并脫頸處死，血液室溫靜置2 h，3000 r/min離心10 min，取上清得血清，依次按各項指標試劑盒說明書進行操作。

1.2.6 小鼠肝臟組織SOD、GSH、CAT、MDA測定

小鼠脫頸處死后，取肝臟并稱重，按肝臟:生理鹽水為1:3的比例制備成組織勻漿，并按試劑盒說明書依次加入反應液進行孵育，測定肝臟組織中SOD、GSH、CAT、MDA活性。

1.2.7 小鼠血清炎癥因子的測定 將收集好的血清使用酶聯免疫吸附（ELISA）法進行炎癥因子的測定，根據試劑盒說明書檢測各組小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6炎癥因子。

1.2.8 小鼠肝臟組織病理學檢測 采用蘇木精和伊紅（HE）染色法分析肝臟組織病理變化，對取出的小鼠肝臟組織用4%多聚甲醛溶液固定，再進行脫水包埋切片，用HE法染色并拍照。

1.3 數據處理

使用SPSS 23.0軟件對數據進行統計學分析和顯著性差異分析，結果以均值±標準偏差表示，P＜0.05表示有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 金銀花黃酮提取物對糖尿病小鼠體重、FBG的影響

金銀花黃酮提取物總黃酮含量為43.62 mg/g，圖1反映了金銀花黃酮提取物對T1DM小鼠體重以及FBG的影響，灌胃8周后，與正常組相比，模型組小鼠體重極顯著降低（P＜0.01），經金銀花黃酮提取物治療后的T1DM小鼠體重均與模型組有極顯著差異（P＜0.01）。經8周的金銀花黃酮提取物灌胃后，各小鼠的FBG差異顯著（P＜0.05），其中金銀花黃酮提取物高劑量組FBG下降最為顯著，可能是由于金銀花黃酮提取物影響了胰島細胞，使其分泌出更多胰島素，從而T1DM小鼠的糖尿病癥狀得以緩解。可見金銀花黃酮提取物能有效緩解T1DM小鼠體重的下降，調節其血糖水平。

圖1 金銀花黃酮提取物對T1DM小鼠體重及FBG的影響Fig.1 Effects of flavonoid extract from Lonicera japonica Thunb. on body weight and FBG of T1DM mice

2.2 金銀花黃酮提取物對糖尿病小鼠OGTT的影響

由圖2可知，各組小鼠血糖值在灌胃后30 min達到最大值，隨后下降，模型組中血糖下降緩慢，與模型組相比，金銀花低、高劑量組均能夠極顯著降低小鼠血糖水平（P＜0.01），能夠提高T1DM小鼠的糖耐量。經金銀花黃酮提取物灌胃后，調節了T1DM小鼠體內各種酶的活性，平衡了對葡萄糖的攝取及利用，提高了其對葡萄糖的耐受能力[23]。楊思等[24]的研究中指出，苦蕎黃酮具有顯著的降血糖效果。可見，黃酮類物質具有調節血糖的能力，具有很好的提高葡萄糖耐受的作用。

圖2 金銀花黃酮提取物對T1DM小鼠OGTT的影響Fig.2 Effect of flavonoid extract from Lonicera japonica Thunb. on OGTT of T1DM rats

2.3 金銀花黃酮提取物對糖尿病小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C的影響

由圖3可知，與正常組相比，模型組小鼠血清的TC、TG、HDL-C、LDL-C水平有極顯著性差異（P＜0.01）；與模型組相比，金銀花黃酮低劑量組TC無顯著性差異（P＞0.05），而金銀花黃酮低劑量組的TG、HDL-C、LDL-C均有極顯著性差異（P＜0.01）。經金銀花黃酮高劑量組治療后能夠極顯著改善TC、TG、HDL-C、LDL-C相關指標的水平（P＜0.01）。這是由于金銀花黃酮提取物經體內吸收后參與了T1DM小鼠的脂代謝，使TC、TG、LDL-C水平降低，HDLC水平提高。有研究指出，經治療后的T1DM小鼠脂代謝水平能夠得到明顯改善，這與本研究結果一致[25]。王佳慧[26]的研究指出，川木瓜黃酮能夠改善T1DM小鼠的異常脂代謝，說明植物黃酮具有調節異常脂代謝的作用，也更加確定金銀花黃酮提取物能夠改善T1DM小鼠異常脂代謝。

圖3 金銀花黃酮提取物對T1DM小鼠TC、TG、HDL-C、LDL-C的影響Fig.3 Effects of flavonoid extract from Lonicera japonica Thunb. on TC, TG, HDL-C and LDL-C in T1DM mice

2.4 金銀花黃酮提取物對糖尿病小鼠SOD、GSH、CAT、MDA的影響

圖4反映了金銀花黃酮提取物對T1DM小鼠氧化應激相關指標的影響，與正常組相比，模型組小鼠肝臟中SOD、GSH、CAT含量均極顯著下降（P＜0.01），MDA含量極顯著升高（P＜0.01），經金銀花黃酮提取物治療后可有效恢復T1DM小鼠的氧化應激水平。有研究顯示，經治療后的T2DM大鼠SOD、GSH、CAT、MDA水平均得到恢復，與模型組差異極顯著（P＜0.01），可見，金銀花黃酮提取物能夠通過改善機體氧化應激相關酶水平從而發揮降血糖作用[27]。

圖4 金銀花黃酮提取物對T1DM小鼠SOD、GSH、CAT、MDA的影響Fig.4 Effects of flavonoid extract from Lonicera japonica Thunb. on SOD, GSH, CAT and MDA in T1DM mice

2.5 金銀花黃酮提取物對糖尿病小鼠TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-6的影響

圖5為金銀花黃酮提取物對T1DM小鼠TNFα、IL-1β、IL-8和IL-6的影響，由圖5可知，與正常組相比，模型組T1DM小鼠炎癥因子含量均有升高，極顯著高于正常組（P＜0.01），而經金銀花黃酮提取物治療后的T1DM小鼠炎癥因子水平均極顯著下降（P＜0.01），且高劑量組效果與陽性組相當。表明金銀花黃酮提取物能夠降低T1DM小鼠炎癥的發生。呂品等[28]通過網絡藥理學研究指出，金銀花具有抗炎抗菌活性，由此也印證了本文的實驗結果。因此，金銀花黃酮提取物能夠降低T1DM小鼠的炎癥反應，有助于治療糖尿病。

圖5 金銀花黃酮提取物對T1DM小鼠TNF-α、IL-1β、IL-8 and IL-6的影響Fig.5 Effects of flavonoid extract from Lonicera japonica Thunb. on TNF-α, IL-1β, IL-8 and IL-6 in T1DM mice

2.6 金銀花黃酮提取物對T1DM小鼠肝臟的影響

圖6為金銀花黃酮提取物對T1DM小鼠肝臟的影響，HE染色結果顯示模型組小鼠肝細胞腫脹，排列紊亂，肝小葉結構消失，細胞內出現大量脂肪空泡，局部伴有炎癥細胞浸潤，出現了明顯的肝損傷，而金銀花黃酮提取物組肝臟結構基本正常，細胞內有少量脂肪空泡及脂滴，炎癥細胞浸潤較少，可見，金銀花黃酮提取物能夠明顯減輕模型小鼠肝臟結構的改變，病理損傷明顯減輕。劉暢等[29]基于網絡藥理學，對金銀花對大鼠急性酒精性肝損傷進行了研究，認為金銀花對肝損傷具有一定的改善作用，與本文的研究結果相符。

圖6 金銀花黃酮提取物對T1DM小鼠肝臟的影響Fig.6 Effects of flavonoid extract from Lonicera japonica Thunb. on liver of T1DM mice

3 討論與結論

近年來，研究者們不斷地從金銀花中分離提取出有機酸類、揮發油類、黃酮類等化合物，在劉昌平[30]的研究中發現，金銀花中黃酮類化合物的含量約占金銀花干重的7.2%。本實驗中，測得所提取的總黃酮含量為44.3 mg/g。由此可見，黃酮類化合物在金銀花中含量較高，而且黃酮類物質有許多生理活性，還具有用量少、安全無毒等優點，因此，對金銀花的開發前景較為廣闊。

黃酮類物質易溶于乙酸乙酯中，因此在提取時選用乙酸乙酯進行萃取。實驗結果顯示，金銀花黃酮提取物能夠緩解T1DM小鼠體重的下降，降低其FBG，提高OGTT，表現出良好的降血糖作用。梅桂雪等[31]研究發現，黃酮類化合物可以通過抑制美拉德反應，增強機體對葡萄糖的攝取，抑制醛糖還原酶，促進胰島素的分泌，控制胰島素敏感性，作用于血管緊張素，抑制α-葡萄糖苷酶，類胰島素作用等，發揮防治糖尿病的作用。朱小峰等[32]對金銀花不同提取物對α-葡萄糖苷酶的抑制活性進行了研究，結果表明金銀花水提物對其抑制率較低，而總浸膏和乙酸乙酯提取物的抑制率可高達108.09%和102.81%，可見金銀花乙酸乙酯提取物即黃酮類物質在體外表現出一定的降血糖活性。金銀花黃酮提取物還顯示出良好的調節T1DM小鼠脂代謝相關指標TC、TG、HDL-C、LDL-C的效果，有研究報道，金銀花水提物能夠顯著降低高血脂小鼠的TC、TG水平，并調節脂代謝相關蛋白的表達[33]。王強等[34]研究發現金銀花黃酮提取物（4.2 g/kg）可使高脂血癥大鼠血清及肝組織TG水平明顯降低。這些均與本文研究結果一致。

糖尿病在發生過程中常伴隨著炎癥反應，研究人員在糖尿病早期的肥胖小鼠體內，發現巨噬細胞侵入胰腺，并釋放出大量促炎蛋白，從而破壞了產生胰島素的β細胞[35]。可見，炎癥引起的免疫反應，會影響胰島素分泌情況，進而導致糖尿病的發生。而糖尿病反過來，又會進一步惡化炎癥。本實驗測定了金銀花黃酮提取物對小鼠炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-8和IL-6的影響，結果顯示金銀花黃酮提取物能夠有效地抑制糖尿病引起的炎癥反應。本文又檢測了T1DM小鼠肝臟組織的病理變化，模型組小鼠肝臟局部伴有炎癥細胞浸潤，出現了明顯的肝損傷，而金銀花黃酮提取物治療后改善了炎癥細胞浸潤狀態，可見，金銀花黃酮提取物能夠明顯減輕T1DM小鼠肝臟炎癥。有研究指出，抑制T1DM小鼠炎癥反應，可以有效抑制胰島細胞凋亡，保護胰島β細胞，減輕其糖尿病癥狀[36-37]。這與本研究結果相符。

因此，金銀花黃酮提取物具有良好的降血糖活性，并能夠改善T1DM小鼠異常脂代謝、炎癥以及肝臟損傷。該研究可為金銀花黃酮的開發與利用提供新的思路，但其對糖尿病的治療機制研究還較為淺顯，后續可對金銀花黃酮提取物的降血糖機制進行進一步深入研究。