鐵皮石斛多糖分離純化及其藥理活性研究進展

張 霞，白月明，謝雪勤，孟 達，車彥云，趙 毅

（云南省藥食同源飲品工程研究中心，云南中醫藥大學，云南昆明 650500）

取法、微波輔助提取法、酶輔助提法、超高壓提取法、閃式提取法等方法提取獲得[6]。鐵皮石斛粗多糖經過去除脂質、色素、單糖、低聚糖、淀粉、蛋白質等雜質，再由凝膠過濾柱色譜法、離子交換色譜法等分離純化得到均一的鐵皮石斛多糖片段。目前對鐵皮石斛多糖結構的研究主要集中在多糖的相對分子質量、單糖的組成及比例、單糖的連接方式、糖苷鍵類型及重復單位等。

近年來，隨著鐵皮石斛多糖及其藥理活性的深入研究，越來越多的研究圍繞鐵皮石斛多糖的結構特征，藥理活性及機制，保健品開發應用等方面展開。基于此，本文對鐵皮石斛多糖的分離純化及相關藥理作用及其機制研究進展進行綜述，以期為鐵皮石斛多糖的開發及應用提供參考。

1 鐵皮石斛多糖的分離純化

實現鐵皮石斛多糖的有效提取和分離純化，是鐵皮石斛多糖結構和藥理活性深入研究的基礎。在鐵皮石斛多糖分離純化中，影響鐵皮石斛多糖含量及純度的主要雜質有色素、單糖、低聚糖、淀粉和蛋白質等[7]。譚青云等[8]以多糖損失率和色素去除率為指標，以活性炭、過氧化氫及大孔樹脂對鐵皮石斛多糖脫色方法進行評估，結果表明大孔樹脂D4020可有效去除多糖色素并有效保留多糖含量，其色素去除率和多糖保留率分別為93.3%和85.3%。將鐵皮石斛粗多糖溶液置于一定截留分子量的透析袋中在蒸餾水中透析即可除去糖、低聚糖等小分子雜質[9]。α-淀粉酶處理可有效去除鐵皮石斛粗多糖中的淀粉[10]。蛋白質對鐵皮石斛多糖的結構特征研究及生物活性探究造成較大干擾，因此，除去粗多糖中蛋白質是多糖分離純化關鍵。除去粗多糖中蛋白質的常用方法主要有Sevag法、酶法、三氯乙酸法和鹽酸法，為了提高蛋白質的去除率，也可將常用方法聯合使用。目前，凍融法、樹脂吸附法、醋酸鉛法、雙醛纖維素法、磁性殼聚糖微球法氯化鈣法等綠色新型除蛋白方法也被廣泛應用[11]。為探究鐵皮石斛多糖的單糖組成、分子質量、連接方式等結構特征，應對鐵皮石斛粗多糖進一步分離純化。常用的分離純化方法有凝膠過濾柱色譜法、離子交換樹脂法、膜分離法、分步沉淀及鹽析純化法、化學沉淀法和電泳法（制備型區域電泳）等。

鐵皮石斛多糖含量受種源、栽培條件、采收時期、干燥方法、提取方法等的影響。相關性分析表明，不同種源地的鐵皮石斛莖粗與多糖含量呈顯著負相關；低海拔地區栽培的鐵皮石斛多糖含量明顯高于中、高地區栽培的鐵皮石斛，大棚栽培的鐵皮石斛多糖含量高于附樹和附石栽培；鐵皮石斛的最佳種植年限為3年，最佳采收期為種植頭年10月至翌年3月；真空冷凍干燥、微波干燥的鐵皮石斛多糖含量高于傳統干燥；凍融法提取和酶法提取的多糖含量高于傳統水提，提取多糖含量受水料比、提取時間、提取溫度、提取次數等的影響[12]。鐵皮石斛多糖分子具有生物大分子的結構特征，分子質量分布廣，從幾百到上百萬不等，單糖組成及連接方式多樣，空間結構復雜。孫恒等[13]、張明澤等[14]、奚航獻等[15]對2010～2019年間分離得到的鐵皮石斛多糖結構特征進行了初步總結，本文在此基礎上，總結了近10年鐵皮石斛多糖的提取、分離純化方法及結構特征等（表1）。鐵皮石斛多糖主要由甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、果糖和巖藻糖組成，也有少量分離純化得到的多糖中含有葡萄糖醛酸以及半乳糖醛酸。多糖分子量及單糖組成與鐵皮石斛多糖的提取、分離純化方法相關。如分別由水提法和纖維素酶輔助法提取后分離純化的多糖的單糖組成不同[23,33]；鐵皮石斛粗多糖經DEAE-52纖維素分離柱分別用水和不同濃度的氯化鈉溶液洗脫，分別得到水溶性多糖和鹽溶性多糖，分子量和單糖組成比例均不相同[25-26]；分離純化得到的鐵皮石斛多糖經β-1,4-甘露聚糖內切酶水解得到酶解多糖片段，分子量由十萬級變為幾百，單糖摩爾比也發生了改變[41]。目前對鐵皮石斛多糖的分離純化重復性較差，一般使用多種方法聯合使用，對結構的分析也僅限于對初級結構的探究。

表1 鐵皮石斛多糖的提取、純化及結構特征Table 1 Extraction, purification and structural characteristics of polysaccharides from Dendrobium officinale

2 鐵皮石斛多糖的藥理作用

鐵皮石斛多糖具有抗氧化、降血糖、降血脂、降血壓、抗疲勞、護肝等多種藥理作用，近年來對改善糖尿病并發癥、保護胃粘膜損傷、抗腫瘤、調節腸道微生態的藥理機制的研究增多，本文主要對此進行總結歸納。不同結構的鐵皮石斛多糖的生物活性有較大差異，如劉袆帆等[48]總結葡萄糖為有無抗氧化活性影響最大的單糖，具有降血糖藥理活性的石斛多糖中都存在葡萄糖及甘露糖，且兩種單糖以其中一種為主干。同一粗鐵皮石斛多糖分級純化得到的多糖，分子量較小的調節免疫活性較強[34]。

2.1 降血糖及改善糖尿病并發癥

研究發現，DOP可有效降低血糖及改善相關并發癥[49]，其機制主要有：a. 恢復胰腺損傷并促進胰島素分泌；b. 提高胰島素敏感度；c. 清除自由基；d. 調節腸道中酶的活性等（圖1、表2）。葡萄糖和甘露糖是具有降血糖功能的DOP中存在的兩個重要單糖，且具有降血糖活性的DOP中甘露糖比例高于葡萄糖[30,42,44]，但DOP的分子量及單糖連接方式與降血糖的關系還需進一步研究。

表2 鐵皮石斛多糖的降血糖、改善相關并發癥作用及機制Table 2 Effects and mechanisms for hypoglycemic and diabetes complication of polysaccharides from Dendrobium officinale

2.2 保護胃粘膜損傷

鐵皮石斛在中醫用藥中常作為“腸胃藥”，《神農本草經》中記載“久服厚腸胃，輕身延年”，《本草再新》中記載“理胃氣，清胃火”。胃粘膜損傷是機體為抵抗物理因素、化學因素、細菌及其毒素等因素侵襲所發生的炎癥反應，人體胃粘膜損傷主要以急慢性胃炎、胃潰瘍等胃部疾病的癥狀體現。保護胃粘膜損傷模型主要體現為胃粘膜上皮細胞增殖與凋亡失衡、胃粘膜保護因子如前列腺素、NO減少、胃酸和胃蛋白酶分泌失衡、炎癥因子增加、胃粘膜局部組織缺血等。研究表明以多糖為主的鐵皮石斛粗提物對各種模型的胃粘膜損傷均具有恢復損傷及保護的作用[54-59]，其保護胃粘膜損傷機制主要包括：平衡胃粘膜上皮細胞增殖與凋亡；下調相關炎癥因子及mRNA的表達；提高抗氧化活性逆轉胃粘膜損傷（圖2、表3）。

圖2 鐵皮石斛多糖保護胃粘膜損傷的作用機制示意圖Fig.2 Schematic on protection of gastric mucosal injury mechanisms of polysaccharides from Dendrobium officinale

續表 1

2.3 抗腫瘤

體外實驗研究表明，鐵皮石斛多糖粗提物具有抗宮頸癌、肝癌、結直腸癌、結腸癌、淋巴瘤等活性[60]，其作用與促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖、促進細胞自噬、增強機體免疫等有關（圖3、表4）。粗提物中可能還含有聯芐類、菲類、生物堿等具有抗腫瘤作用的活性成分，限制了DOP抗腫瘤機制的深入研究，因此純化分離DOP對鐵皮石斛的抗腫瘤研究具有重要意義。

表4 鐵皮石斛多糖的抗腫瘤作用及機制Table 4 Treatments and mechanisms for anti-tumor of polysaccharides from Dendrobium officinale

圖3 鐵皮石斛多糖抗腫瘤的作用機制示意圖Fig.3 Schematic on anti-tumor mechanisms of polysaccharides from Dendrobium officinale

2.4 調節腸道微生態

腸道微生物群影響人體營養物質吸收、轉化、代謝與合成；形成生物屏障，阻止致病菌入侵；作為抗原，刺激宿主產生抗體，增強免疫力[65]。腸肝軸理論、腸胃軸理論、腸腦軸理論和腸腎軸理論都揭示了臟器疾病的發生會導致腸道微生態失衡，腸道微生態的失衡也會影響臟器疾病的發生[66]。

鐵皮石斛多糖調節腸道微生態的作用主要有:a.調整腸道微生態結構：鐵皮石斛多糖對乳酸菌、雙歧桿菌由明顯的增殖作用，對大腸桿菌有一定的抑制作用；b.調節腸道酶活性：鐵皮石斛能夠調節腸道中蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶和木聚糖酶的活性，改善脾虛便秘癥狀。研究表明，給與正常小鼠鐵皮石斛多糖后，小鼠的脾臟系數、胸腺系數、真菌和雙歧桿菌菌落計數均升高；細菌和大腸肝菌的菌落計數降低；淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶和纖維素酶活性均升高，改善了小鼠的腸道功能[66]。

2.5 其他

鐵皮石斛多糖作為天然的外源性抗氧化劑，不僅能直接清除自由基，又可提高機體內抗氧化酶活力，表現出很好的抗氧化力，減輕自由基對機體的損傷[20]。婁瀟琳[67]發現鐵皮石斛多糖可對小鼠T盒子轉錄因子（T-box transcription factor，T-bet）和GATA連接蛋白3（GATA binding protein 3，GATA-3）的表達以及干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）和IL-4的分泌起促進作用，可提高機體整體的免疫能力。鐵皮石斛多糖可以預防與保護由順鉑造成的雄性小鼠生殖系統損傷，有效促進生殖系統的損傷恢復[68]。鐵皮石斛多糖還可通過減少細胞內脂質過氧化物的產生的及清除活性氧對缺氧/復氧的H9c2細胞起到較好的保護作用[69]。

3 總結與展望

近年來，鐵皮石斛廣泛應用于保健食品的開發，以鐵皮石斛為主原料的保健食品類型主要有片劑、膠囊、口服液、飲品、沖劑、含片、浸膏等，但其功效較單一，以增強免疫力及緩解體力疲勞為主。基于鐵皮石斛多糖具有降血糖及調節腸道微生態等作用，未來有望將鐵皮石斛開發成具有調節血糖、改善腸道消化功能、控制體重的功能性食品。目前鐵皮石斛開展按照傳統既是食品又是中藥材的物質生產經營試點工作，其產品逐漸呈現多元化的趨勢，發酵酒、餅干、發酵飲料等食品研究領域均有應用。

但整體而言，鐵皮石斛開發仍舊處于較低水平，分析其原因：a. 受種源、栽培條件、采收季節、提取方法、分離純化方法等的影響，鐵皮石斛多糖分離純化的重復性較差，目前主要對其初級結構進行研究；b. 多糖結構不夠清晰，限制了生物活性與結構關系的深入探究；c. 市場上的鐵皮石斛來源復雜，優劣混雜，地方標準不適用于不同來源的鐵皮石斛，目前暫無一個可適用于鐵皮石斛食品開發的國家標準，導致相關產品開發受到制約；d. 精深加工技術水平較低，產品開發相對單一，未能打造知名品牌產品。基于以上存在的問題，在未來的研究中，應進一步優化鐵皮石斛多糖分離純化的方法及技術，完善結構分析方法，使其結構特征更清晰化，為探究鐵皮石斛多糖結構與其生物活性之間的關系提供有效依據；加強鐵皮石斛原料市場的監管，抵制以假亂真，以次充好的市場現狀，制定相關標準；加大創新力度，使用現代高新技術開發精深加工產品，保證產品具有獨特優勢，提高鐵皮石斛的附加值。