支氣管哮喘不同炎癥表型患者的T淋巴細胞亞群及相關細胞因子的表達水平及意義

任莉莉, 汪文娟, 姑麗娜扎爾·艾比布拉, 古力鮮·馬合木提

(新疆醫(yī)科大學第七附屬醫(yī)院 呼吸內科, 新疆 烏魯木齊, 830028)

支氣管哮喘是呼吸系統(tǒng)常見疾病，主要由免疫細胞及其分泌的炎性因子介導。根據(jù)誘導痰液中炎性細胞的類型，可將支氣管哮喘分為嗜酸性粒細胞型、中性粒細胞型、寡粒細胞型和混合粒細胞型共4種炎癥表型，不同表型對治療的反應程度不同，預后也相差很大[1-3], 因此探討不同炎癥表型患者T淋巴細胞及炎性因子的分布情況對于疾病的個性化治療至關重要。研究[4-5]表明，輔助性T細胞1與輔助性T細胞2比值(Th1/Th2)失衡是支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展的重要機制，而免疫細胞相關炎性因子的釋放則加速了疾病進展。白細胞介素-4(IL-4)是Th2細胞的特征性細胞因子[6], γ干擾素(INF-γ)是Th1細胞的特征性細胞因子[7], 白細胞介素-17(IL-17)則是一種促炎因子，參與哮喘的進展[8], 轉化生長因子-β1(TGF-β1)具有促纖維化和抗炎等功能[9]。本研究觀察支氣管哮喘不同炎癥表型患者血清T淋巴細胞亞群及相關細胞因子的表達情況，現(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究為回顧性研究，納入2020年6月—2021年12月本院住院治療的100例支氣管哮喘急性發(fā)作患者為研究對象。納入標準: ① 符合中華醫(yī)學會呼吸病學分會哮喘學組制訂的支氣管哮喘診斷標準者[10]; ② 年齡>18歲者; ③ 患者知情同意，并上報醫(yī)院倫理委員會備案; ④ 臨床資料完整者。排除標準: ① 合并其他呼吸系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病者; ② 合并心、肝、腎等臟器功能不全者; ③ 合并惡性腫瘤者; ④ 近2周內使用免疫抑制劑、激素等干擾本研究結果的藥物者; ⑤ 合并感染性疾病者; ⑥ 妊娠、哺乳期婦女。根據(jù)誘導痰液中性粒細胞(N)和嗜酸性粒細胞(E)百分比結果，將患者分為嗜酸性粒細胞型組(E≥3%和N<61%)51例、中性粒細胞型組(N≥61%或E<3%)31例、混合粒細胞型組(E≥3%和N≥61%)11例和寡粒細胞型組(N<61%和E<3%)7例。

1.2 方法

所有患者住院后完善相關檢查，并給予相應的治療，包括吸氧、抗感染、止咳、化痰、霧化吸入，同時囑患者保持清淡飲食，脫離過敏原，維持內環(huán)境穩(wěn)定。所有患者在入院后、治療后各抽取空腹肘靜脈血10 mL, 一份1 500 轉/min離心15 min, 保留血清, -80 ℃保存待測; 另一份加入乙二胺四乙酸二鉀抗凝，采用流式細胞術檢測相關指標。

1.3 觀察指標

CD4+T細胞水平檢測: 向血清中加入CD3-FITC(553062, BD Biosciences)、CD4-PE(553730, BD Biosciences)、INF-γ-PE(12-1191-82, Invitrogen)和IL-4-APC(17-7041-82, Invitrogen)兔抗人單克隆抗體，充分混勻, 4 ℃避光孵育45 min。4%多聚甲醛固定10 min, 采用CytoFLEX型號流式細胞儀(Beckman, 德國)進行檢測，先設定T淋巴細胞，然后按照CD3圈門，檢測INF-γ+CD4+(Th1)、IL-4+CD4+(Th2)細胞數(shù)量。

細胞因子檢測: 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清IL-4、IL-17、TGF-β1及INF-γ含量，試劑盒購自Invitrogen公司，嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 11.0軟件處理數(shù)據(jù)，表達量采用均數(shù)±標準差表示，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)在多組間比較采用單因素方差分析，多組內兩兩比較采用Bonferroni(LSD)法。計數(shù)資料采用[n(%)]表示，組間比較采用χ2檢驗。細胞因子與嗜酸性粒細胞百分比、中性粒細胞百分比的相關性采用Pearson相關分析。采用Logistic回歸模型分析不同炎癥表型的影響因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組患者一般資料比較

各組患者性別、年齡、病程比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05), 但各組患者過敏史、吸煙史及疾病嚴重程度的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2 各組患者Th1/Th2、IL-4、INF-γ水平比較

嗜酸性粒細胞型組、寡粒細胞型組Th1/Th2、INF-γ水平低于中性粒細胞型組、混合粒細胞型組, IL-4水平高于中性粒細胞型組、混合粒細胞型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表1 各組患者一般資料比較

表2 各組Th1/Th2、IL-4、INF-γ水平比較

2.3 各組IL-17、TGF-β1含量比較

嗜酸性粒細胞型組、寡粒細胞型組TGF-β1水平高于中性粒細胞型組、混合粒細胞型組, IL-17水平低于中性粒細胞型組、混合粒細胞型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組IL-17、TGF-β1含量比較

2.4 嗜酸性粒細胞百分比、中性粒細胞百分比與臨床指標的相關性

患者嗜酸性粒細胞百分比與過敏史、IL-4、INF-γ、TGF-β1呈顯著正相關(P<0.05), 與疾病嚴重程度、Th1/Th2、IL-17呈顯著負相關(P<0.05); 患者中性粒細胞百分比與疾病嚴重程度、吸煙史、Th1/Th2、IL-17呈顯著正相關(P<0.05), 與IL-4、INF-γ、TGF-β1呈顯著負相關(P<0.05)。見表4。

表4 嗜酸性粒細胞百分比、中性粒細胞百分比與臨床指標的相關性

2.5 哮喘分型的多因素Logistic回歸分析

根據(jù)痰嗜酸性粒細胞百分比(界值為3%), 將哮喘患者分為嗜酸性粒細胞哮喘和非嗜酸粒細胞哮喘; 根據(jù)痰中性粒細胞百分比(界值為61%), 將哮喘患者分為中性粒細胞哮喘和非中性粒細胞哮喘。多因素Logistic回歸分析結果顯示，過敏史、Th1/Th2降低、IL-4升高、INF-γ升高、TGF-β1升高、IL-17降低是嗜酸性粒細胞哮喘的危險因素(P<0.05或P<0.01); 吸煙史、Th1/Th2升高、IL-4降低、INF-γ降低、TGF-β1降低、IL-17升高是中性粒細胞哮喘的危險因素(P<0.05或P<0.01)。見表5、6。

表5 嗜酸性粒細胞哮喘的多因素Logistic回歸分析

表6 中性粒細胞哮喘的多因素Logistic回歸分析

3 討 論

支氣管哮喘是一種慢性炎癥疾病，目前普遍認為哮喘的發(fā)生發(fā)展過程與T淋巴細胞、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞等密切相關。CD4+Th細胞根據(jù)其分泌細胞因子及功能的不同，可分為Th1細胞、Th2細胞, Th1/Th2失衡被認為是哮喘發(fā)作的根本原因[11]。根據(jù)痰液中炎性細胞比例的不同，支氣管哮喘可分為不同炎癥表型。本研究發(fā)現(xiàn)嗜酸性粒細胞型患者伴有過敏史的比率較高，而國內外臨床研究[12-13]發(fā)現(xiàn)過敏史是哮喘的危險因素，本研究也證實過敏史是嗜酸性粒細胞型支氣管哮喘的危險因素，提示對此種類型支氣管哮喘應及早進行過敏原檢測，切斷激發(fā)途徑，早期應用激素以促進嗜酸性粒細胞的凋亡。本研究還發(fā)現(xiàn)中性粒細胞型哮喘吸煙比率較高，是引發(fā)哮喘的危險因素，分析原因可能與煙霧中的尼古丁等物質損傷氣管上皮細胞、破壞免疫屏障有關，進而引起中性粒細胞的浸潤。研究[14]證實，吸煙的哮喘患者臨床特征、氣道病理改變與慢性阻塞性肺疾病類似，如糖皮質激素治療不敏感，氣道中性粒細胞浸潤為主。有學者[15]觀察了哮喘與慢性阻塞性肺疾病重疊患者的氣道炎癥改變，發(fā)現(xiàn)炎癥改變相似的患者均有吸煙病史。

Th1細胞主要介導抑炎反應，分泌IFN-γ等炎性因子，對哮喘的發(fā)展起到抑制作用; Th2細胞主要介導體液免疫，主要分泌 IL-4等炎性因子[16]。正常情況下, IFN-γ 和IL-4水平保持相對平衡，維持Th1/Th2的動態(tài)平衡，當人體呼吸道受到抗原刺激后, Th2細胞增多，促進IL-4的分泌，抑制 IFN-γ水平，導致Th1/Th2失衡，進而促進各種炎性細胞的浸潤，加速哮喘進展。本研究結果顯示，嗜酸性粒細胞型患者Th1/Th2低于中性粒細胞型患者，提示嗜酸性粒細胞型支氣管哮喘患者的Th1/Th2失衡更為嚴重。研究[17]證實嗜酸性粒細胞百分比越高則哮喘越嚴重，與本研究結果基本一致。本研究結果還顯示，嗜酸性粒細胞型支氣管哮喘患者血漿IL-4水平高于中性粒細胞型患者, INF-γ水平低于中性粒細胞型患者，這與嗜酸性粒細胞型主要由Th2細胞介導的觀點一致。分析原因可能是IL-4通過促進免疫球蛋白E(IgE)的分泌而增加嗜酸性粒細胞的聚集，同時IL-4可抑制Th1細胞分泌INF-γ。

TGF-β1生物學功能廣泛，具有抗炎、促纖維化的作用。研究[18]表明，TGF-β1與哮喘的氣道炎性反應、氣道重塑有關。研究[19]發(fā)現(xiàn), TGF-β1具有促進炎癥反應的功能，可誘導多種炎性細胞的聚集。嗜酸性粒細胞分泌的TGF-β1可將多種炎性細胞富集到氣道中，發(fā)揮抗炎作用。本研究結果顯示，嗜酸性粒細胞型患者TGF-β1含量較高，與嗜酸性粒細胞的數(shù)量有關，且TGF-β1是嗜酸性粒細胞型的危險因素，推測TGF-β1可能是嗜酸性粒細胞型哮喘的標記物。IL-17是一種前炎性細胞因子，可促進多種細胞釋放炎性因子。支氣管哮喘患者體內IL-17可誘導上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞等分泌IL-6、IL-8，募集中性粒細胞、嗜酸性粒細胞，加速氣道炎癥反應[20-22]。研究[23]顯示, IL-17與哮喘氣道內中性粒細胞數(shù)目增多有關。本研究結果顯示，中性粒細胞型患者IL-17含量較高，與中性粒細胞的數(shù)量有關，且IL-17是中性粒細胞型的危險因素，推測IL-17可能是中性粒細胞型哮喘的標記物。上述結果提示, IL-17、TGF-β1可能是支氣管哮喘炎性表型的標記物及風險因子，臨床可通過檢測相關指標，根據(jù)分型精準用藥，提高疾病治愈率。

綜上所述，支氣管哮喘患者不同炎癥表型在臨床特征、淋巴細胞亞群及炎性因子方面存在差異，臨床醫(yī)師可檢測不同細胞因子判斷炎癥表型，制訂個性化的治療方案。