基于網絡藥理學預測梔子大黃湯抗肝損傷的作用機制

趙劍鋒, 陳 凱

(1. 江蘇省泰興市中醫院 院辦, 江蘇 泰興, 225400;2. 南京醫科大學泰州臨床醫學院/南京醫科大學附屬泰州人民醫院 藥學部, 江蘇 泰州, 225300)

梔子大黃湯為漢代張仲景所著《金匱要略》中經典名方，由梔子、大黃、枳實和淡豆豉4味藥材組成。方中梔子、大黃清泄濕熱，枳實破氣行滯，淡豆豉輕清宣散，諸藥相合，共奏清肝利膽、理氣退黃之效[1]。現代藥理學研究[2]表明，梔子大黃湯具有顯著的利膽、抗炎活性。目前，梔子大黃湯已被廣泛應用于熱重濕輕之肝膽疾患或心經郁熱者的臨床治療，如新生兒病理性黃疸、黃疸型肝炎等[3-4]。然而梔子大黃湯的作用機制尚未闡明，加之中藥成分復雜，作用靶點和途徑較多，故其藥效物質基礎及作用機制仍需進一步探索。網絡藥理學的概念于2007年由英國學者Hopkins提出，其基于系統生物學、藥理學、計算分析等多學科理論，多層次探討藥物干預疾病的分子機制。大量研究[5-7]發現，基于網絡藥理學方法研究中藥的作用機制符合中醫藥的整體作用特點，且效果準確可靠。本研究基于網絡藥理學方法篩選梔子大黃湯的活性成分和靶點，構建“藥材-活性成分-靶點”網絡模式，旨在為進一步闡述梔子大黃湯抗肝損傷的作用機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 梔子大黃湯潛在活性成分篩選

通過中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP Ver 2.3, http://tcmspw.com/tcmsp.php)、中醫藥百科全書數據庫(ETCM, http://www.tcmip.cn/ETCM/)檢索梔子、大黃、枳實和淡豆豉化合物，建立梔子大黃湯化學成分數據庫。篩選口服生物利用度(OB)≥30%且類藥性(DL)≥0.18的化合物作為潛在活性成分，并納入相關文獻[8-9]報道的重要活性成分。

1.2 潛在活性成分相關基因靶標獲取與“藥材-活性成分-靶點”網絡構建

借助STITCH DB Ver 5.0(http://stitch.embl.de)進行研究，物種設置為“智人”，閾值設置為默認，將有證據驗證的靶點基因納入成分相關靶點，否則剔除。通過Cytoscape 3.7.0軟件構建“藥材-活性成分-靶點”網絡，并分析節點和邊。

1.3 疾病相關靶點獲取

肝損傷相關靶點來源于GeneCards Ver 5.12.0(https://www.genecards.org)和Pharm GKB (https://www.pharmgkb.org), 檢索關鍵詞"liver injury", 其中GeneCards數據庫選取相關性大于1的靶點。將獲得的靶點通過Uniport數據庫(https://www.uniprot.org)進行名稱標準化。

1.4 藥物-疾病靶點網絡建設

為了明確梔子大黃湯治療肝損傷潛在靶點之間的相互作用，將藥物成分靶點與疾病靶點進行交集。應用STRING平臺(https://string-db.org, Ver 11.0)進行分析，蛋白來源種類設置為“智人”，相互作用閾值設置為默認，獲取蛋白-蛋白相互作用(PPI), 然后通過Cytoscape軟件構建PPI網絡。通過Cytoscape軟件的CytoNCA插件獲得PPI網絡中的自由度中心性(DC)、介度中心性(BC)、接近性中心性(CC)、特征向量中心性(EC)、網絡中心性(NC)、局部邊連通性(LAC)。篩選標準: 指標數值大于中位數，即為關鍵基因。

1.5 基因通路與功能分析

借助R語言軟件(Ver 4.03)的clusterprofiler包將藥物與疾病交集的靶標基因名轉化成基因ID, 并對梔子大黃湯潛在抗肝損傷靶點進行基因本體(GO)功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(KEGG)信號通路富集分析。以q≤0.05為閾值，再應用R語言軟件中的ggplot包繪制條形圖。

1.6 化合物與靶點相互作用的分子對接

為了闡明潛在化合物與其潛在靶標的相互作用，選擇關鍵靶點基因與活性化合物進行分子對接。通過PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)獲得所選活性化合物的SDF結構，然后通過ChemBio3D 17.0獲得化合物最低能量的MOL2結構。關鍵靶點基因對應蛋白質的晶體結構來源于PDB數據庫(http://www.rcsb.org), 優先選擇“智人”種屬、分辨率大于2.5 ?、含有活性配體、X射線晶體結構蛋白質的晶體結構，利用PyMol軟件進行去水、加氫、調整電荷等預處理。使用Autodock 4.2和AutodockTool計算所選化合物和目標靶點蛋白之間的結合親和力。目標靶點蛋白包括細胞間黏附分子-1(ICAM-1)(PDB ID: 1P53)、腫瘤壞死因子(TNF)(PDB ID: 1TNR)、基質金屬蛋白酶9(MMP9)(PDB ID: 6ESM)的X射線晶體結構) 和白細胞介素-10(IL-10)(PDB ID: 2H24)。

2 結 果

2.1 活性化合物的篩選與網絡構建

通過TCMSP和ETCM數據庫檢索梔子、大黃、枳實、淡豆豉化合物，以OB≥30%且DL≥0.18為條件篩選出活性成分81個(其中18個來自梔子, 21個來自大黃, 33個來自枳實, 9個來自淡豆豉)，剔除重復成分10個，最終獲得71個成分。利用STITCH數據庫共檢索到138個相關靶點基因，無靶點基因的化合物未被納入本研究，最終共獲得31種活性成分，見表1。利用通過Cytoscape軟件構建的“藥材-活性成分-靶點”網絡進行拓撲分析，共有169個節點和460條對應相互關系的邊，見圖1。

2.2 肝損傷相關靶點篩選

檢索GeneCards、PharmGKB數據庫，分別獲取肝損傷相關靶點401、20個，剔除重復項，校正后最終獲得341個靶點。

2.3 梔子大黃湯抗肝損傷PPI網絡構建與關鍵靶點篩選

將341個疾病相關靶點與138個化合物靶點取交集，得到共同靶點47個，見圖2。應用Cytoscape軟件構建梔子大黃湯藥材抗肝損傷的PPI網絡，靶點-靶點相互作用關系的邊共410條。

表1 梔子大黃湯中活性成分的基本信息

采用CytoNCA插件根據網絡節點的拓撲屬性進行2次篩選，共獲取關鍵靶點基因7個，包括TNF、血紅素加氧酶1(HMOX1)、白細胞介素-6(IL6)、絲裂原激活蛋白激酶8(MAPK8)、前列腺素內過氧化物合成酶2(PTGS2)、熱休克蛋白90 Alpha家族A級成員1(HSP90AA1)、半胱天冬酶3(CASP3), 見圖3。

2.4 GO功能富集分析

GO功能富集分析結果見圖4, 橫軸表示基因富集數目，縱軸為富集條目,q值用不同顏色表示，顏色越深表示差異性越顯著。① 生物過程(BP)注釋主要包括: 對外源物質的反應; 類固醇代謝過程; 對脂多糖的反應; 對氧化應激的反應; 對細菌源分子的反應; 細胞對化學應激的反應; 外源生物代謝過程; 細胞對外源性刺激的反應; 脂肪酸代謝過程; 小分子代謝過程的調控。② 細胞組成(CC)注釋主要包括: 膜筏; 質膜微區; 內吞囊泡腔; 囊泡腔; 乳糜微粒; 轉錄調控復合體; 小窩蛋白; 極低密度脂蛋白顆粒; 富含甘油三酯的血漿脂蛋白顆粒; 內吞膜泡。③ 分子功能(MF)注釋主要包括: 氧化還原酶活性，作用于成對供體，以分子氧、還原黃素或黃素蛋白為1個供體，摻入1個原子氧; 血紅素結合; 單加氧酶活力; 四吡咯結合; 氧化還原酶活性，作用于配對的供體，結合或減少分子氧; 甾體羥化酶活性; 氧化還原酶活性，作用于配對的供體，與分子氧結合或還原, NAD(P)H作為1個供體，并結合1個氧原子; 鐵離子結合; 芳香化酶活性; 核受體活性。

2.5 KEGG信號通路富集分析

根據 KEGG富集條目繪制前15條信號通路的條形圖，其中橫軸表示富集數目，縱軸表示通路名稱，不同顏色表示不同大小的q值，見圖5。結果顯示，梔子大黃湯抗肝損傷通路主要與脂質和動脈粥樣硬化、百日咳、非酒精性脂肪肝、化學致癌-受體激活、IL-17信號通路、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路、流體剪切力與動脈粥樣硬化、耶爾森菌感染、恰加斯病、胰島素抵抗、TNF信號通路、細胞色素P450對外源物質的代謝、化學致癌-活性氧、甾體激素生物合成、酒精性肝病相關。

2.6 分子對接結果

對PPI網絡中的基因進行2次篩選后共獲得7個關鍵靶點基因，從PDB數據庫下載其對應蛋白質的晶體結構，即TNF(PDB: 7JRA)、HMOX1(PDB: 3HOK)、IL6(PDB: 1ALU)、MAPK8(PDB: 4L7F)、PTGS2(PDB: 5F1A)、HSP90AA1(PDB: 2YI7)、CASP3(PDB: 1RHJ), 在此基礎上進行關鍵靶點與活性成分的分子對接。通過結合能評估對接結果，結合能越小表示分子對接效果越好，結合能數值小于-7 kcal/mol表示結合活性較好，結合能數值小于-9 kcal/mol表示結合活性非常好。分子對接結果顯示，大黃素-TNF、蘆薈大黃素-HSP90AA1、黃柏酮-CASP3這3組典型分子對接的結合活性均很高，見圖6。借助PyMol軟件將這3組分子對接結果進行可視化，結果見圖7。

3 討 論

梔子大黃湯組方出自《金匱要略》，臨床應用歷史悠久，目前涉及該組方中單味藥材的研究已有報道[10], 但關于全方藥材及其應用于肝損傷治療的藥效物質基礎與作用機制的研究尚很少見。本研究采用網絡藥理學方法篩選梔子大黃湯的活性成分，基于成分-靶點相互作用分析篩選關鍵作用靶點，并通過富集分析篩選關鍵作用通路，最后采用分子對接技術對關鍵活性成分與關鍵靶點的結合活性進行驗證。結果顯示，梔子大黃湯的化學成分復雜，基于數據庫檢索與OB、DL篩選共檢出71種植物化學成分，其中大部分成分來源于枳實，來源于淡豆豉的成分最少。從化學結構上看，篩選出的潛在活性成分主要為環烯醚萜苷類、蒽醌類、黃酮類、異黃酮類，與既往研究[11-13]結論一致。

肝損傷是指在一系列理化因素作用下，肝細胞發生不同程度的腫脹、變性、壞死和凋亡，是各種肝病發生與發展的共有病理特征。肝損傷若不能及時被糾正，將使肝病慢性化，進而導致更嚴重的肝臟疾病。因此，通過清除自由基、抑制肝細胞凋亡、抑制炎性反應減輕肝組織炎癥、修復受損肝細胞，從而緩解肝損傷具有重要意義[14]。肝損傷可歸屬于中醫學“脅痛”“黃疸”“酒疸”“藥毒”“積聚”“臌脹”等范疇[15], 《黃帝內經》亦明確指出，脅痛的發生主要與肝膽病變相關。目前，肝損傷治療藥物大多存在作用途徑單一、療效不足、副作用大等問題，而中醫藥辨證治療肝損傷歷史悠久，開發潛力巨大，其中桅子大黃湯為代表方之一。近年來，諸多學者將現代科技應用于桅子大黃湯治療肝損傷的實驗研究，并取得了一定進展。劉天鳳等[16]采用α-萘異硫氰酸酯 (ANIT)制備大鼠急性肝內膽汁淤積模型，發現乙酸乙酯部位為梔子大黃湯抗肝內膽汁淤積的有效部位，能顯著改善模型大鼠血清丙氨酸轉氨酶(ALT)、總膽紅素(TBIL)水平，并顯著改善血清堿性磷酸酶(ALP)、總膽汁酸(TBA)、γ-谷氨酰轉肽酶(γ-GT)和肝組織丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)水平。李倫等[17]研究了梔子大黃湯對四氯化碳所致小鼠急性肝損傷的保護作用，發現梔子大黃湯可顯著降低血清ALT、天冬氨酸轉氨酶(AST)、MDA水平，提升肝組織SOD活性，減輕肝細胞變形、壞死程度，其藥效機制與下調肝組織Bax、Cleaved-Caspase-3表達和上調Bcl-2表達有關。張曉書等[18]建立體內外酒精性肝損傷模型發現，梔子大黃湯可有效降低模型組大鼠升高的血清ALT、AST和甘油三酯(TG)水平，并降低受損肝組織中MDA含量，提升肝組織SOD活性和谷胱甘肽(GSH)含量，對酒精性肝損傷具有明顯的防治作用。

中藥復方具有整體性和多樣性的特點，可發揮多層次、多環節、多靶點綜合作用，所以梔子大黃湯對肝損傷的防治作用可能來源于多重藥理作用與分子機制。本研究通過檢索并篩選獲得341個疾病相關靶點與138個藥物潛在靶點，將其交集后得到47個交集靶點，進一步對靶點-靶點進行網絡拓撲學分析，篩選出TNF、HMOX1、IL6、MAPK8、PTGS2、HSP90AA1、CASP3為梔子大黃湯治療肝損傷的關鍵靶點基因。多種因素會對肝臟造成損傷，導致肝臟出現炎癥，因此抑制炎癥是緩解肝損傷的重要途徑之一。TNF、IL6、PTGS2是參與炎癥反應的關鍵效應因子，梔子大黃湯可通過降低TNF、IL6、PTGS2等炎癥因子水平發揮防治肝損傷的效果。Caspase-3作為Caspase家族成員中執行細胞凋亡的關鍵酶之一，是細胞凋亡的中樞效應器，可被多種刺激因素激活，經剪切活化成Cleaved-Caspase-3, 然后裂解多種蛋白，阻止DNA復制和細胞修復，破壞細胞核整體結構，最終導致細胞凋亡。梔子大黃湯可以抑制Caspase-3活化，減少肝細胞的凋亡，從而緩解肝臟損傷。GO功能分析和KEGG通路分析結果表明，梔子大黃湯可降低肝臟脂質過氧化水平，提高抗氧化酶水平，從而發揮抗氧化應激作用，還可通過抑制TNF信號通路發揮抗炎作用，與相關研究[13-15]結論一致。此外，分子對接結果表明梔子大黃湯中關鍵活性成分大黃素、蘆薈大黃素、黃柏酮等與關鍵蛋白TNF、CASP3等的結合活力非常高，進一步確證梔子大黃湯能夠通過抑制氧化應激、炎癥反應、肝細胞凋亡等途徑發揮治療肝損傷的效果。