UPLC-MS/MS測定啤酒中茚嗪氟草胺及其代謝物殘留量

吳敏蓮，黃偉乾，吳俊發，吳國輝，葉 玲，黃曼谷

（廣州檢驗檢測認證集團有限公司 國家加工食品質量檢驗中心（廣東），廣東 廣州 511447）

除草劑是一類廣泛應用在農業發展上，用于防治雜草和有害植物的藥劑。其中三嗪類除草劑成本較低，針對于闊葉和禾本科雜草有很好的抑制作用[1]。通過作用于光合系統Ⅱ，影響電子傳遞，從而抑制植物的光合作用[2-3]，達到除草效果。茚嗪氟草胺是拜耳作物科學公司近年來研發的一種新型三嗪類除草劑，因此相關的毒理研究報道尚較少。有研究表明，三嗪類除草劑能對生物體脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）造成一定的損傷[4]，并引起生物體的生理紊亂[5]。同時，除草劑的實用也可能對作物的產量造成影響[6-7]，甚至會對一些昆蟲的生理造成損傷[8-9]。在釀造工業中，作物在預處理不充分的情況下，除草劑較容易在酒中殘留[10-11]，從而對消費者的健康造成威脅。同時，雖然茚嗪氟草胺目前只在澳大利亞及美國等一些美洲國家登記使用，但在中國仍未登記，因此相關的檢測方法和法律法規仍未建立，可能存在貿易輸入或不法商家濫用的風險，建立有效測定酒中除草劑的分析方法意義重大。

目前，除草劑的檢測方法主要集中在液相色譜法[12]、氣相色譜法[13-14]、液相色譜-串聯質譜法[15-19]和氣相色譜-質譜法[20-25]。其中，液相色譜法和氣相色譜法靈敏度相對質譜法較低，對目標物選擇性較差，因此，結果容易受到雜質的影響，使結果造成偏差。液相色譜-串聯質譜法和氣相色譜-質譜法對目標物選擇性強，對多組分進行分析時，時間短，且儀器靈敏度較高，適合農藥殘留量的分析測定。本研究基于分散固相萃取技術，建立了同時測定啤酒中茚嗪氟草胺及其代謝物的液相色譜-串聯質譜法（ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS），該方法相對于目前普遍的三嗪類除草劑分析方法，分析時間短，選擇性強，可同時對代謝物殘留量進行監測，目前國內外的相關分析方法報道較少，可為后續研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

啤酒：廣州市售；無水硫酸鎂、氯化鈉（分析純）：廣州化學試劑廠；中性氧化鋁（alumina N，Al-N）；N-丙基乙二胺（primary secondary amine，PSA）、石墨化碳黑（graphitized carbon black，GCB）、硅膠鍵合十八烷基（silica gel bonded octadecyl，C18）；甲醇、乙酸乙酯、乙腈（均為色譜純）：美國Fisher公司；1-氟乙基三嗪二胺、三嗪-茚滿酮、茚嗪氟草胺-烯烴、茚嗪氟草胺標準品（純度≥93.0%）：德國拜爾公司；實驗用水為經Milli-Q純水系統制得的超純水（電阻率為18.2 MΩ·cm-1）。

1.2 儀器與設備

API4000QTRAP質譜儀：美國ABSCIEX公司；LC-20AD島津液相色譜系統：日本島津公司；Milli-Q Advantage A10超純水系統：法國Merck Millipore公司；TGL-16MH2050R高速離心機：湘儀離心機儀器有限公司；NMSG-12多管渦旋震蕩儀：泰州諾米醫療科技有限公司；KQ-500DE超聲波清洗機：昆山市超聲儀器有限公司；Vibramax 100臺式搖床：德國Heidolph公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液的配制

分別準確稱取4種標準品各0.010 0 g于100 mL棕色具塞容量瓶中，用乙腈定容，配制成100 mg/L儲備液，用空白基質溶液稀釋至質量濃度分別為1.00 μg/L、2.00 μg/L、5.00 μg/L、10.0 μ g/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L的標準工作溶液。

1.3.2 樣品前處理

提取：稱取2 g試樣（精確至0.01 g）于50 mL聚四氟乙烯具塞離心管中，加入8 mL水，振搖使分散均勻，再加入10 mL乙腈，渦旋振蕩1 min，加入4 g無水硫酸鎂和1.0 g氯化鈉的混合粉末，迅速振搖，渦旋振蕩提取15 min，以4 000 r/min離心5 min。

凈化：稱取（100±5）mgC18置于2mL聚四氟乙烯具塞離心管中，移取待凈化液1 mL至此離心管中，渦旋混合2 min，以12 000 r/min離心5 min，0.22 μm有機相濾膜過濾，取濾液備用待測。

1.3.3 色譜及質譜條件

色譜條件：Waters Atlantis T3色譜柱（150 mm×2.1 mm，3.0 μm）；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL；流動相A為乙腈，B為0.1%甲酸（含5 mmol/L甲酸銨）-水（V/V），采用等度洗脫方式洗脫分離：0.0～5.0 min，80%A-20%B；流速：0.35 mL/min。

質譜條件：離子源為電噴霧電離源，離子化模式為正離子模式，氣簾氣35 psi，毛細管電壓5 500 V，離子源溫度550 ℃，霧化氣壓力50 psi，加熱輔助氣壓力50 psi，碰撞氣（CAD）：medium，采集模式為多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）。

1.3.4 前處理條件和基質效應的探討

以陰性樣品為實驗對象，回收率為考察指標，優化固相萃取劑及用量和乙腈提取用量，另外，以空白樣品處理后的基質液配制標準溶液，使用基質效應公式計算相應結果。

1.3.5 方法學驗證

選取陰性樣品進行低濃度加標，以信噪比確定方法的檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ），按照定量限的1、2、10倍進行加標回收實驗，每個水平重復6次平行樣品，所得回收率計算相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.6 數據處理

所得數據以Excel 2016軟件統計并進行計算，以公式擬合標準曲線方程和計算出回收率和相對標準偏差，目標物的定量離子流圖導出后，用Origin 8.5軟件重新繪制。

2 結果與分析

2.1 色譜條件及質譜條件的確定

由于茚嗪氟草胺及其3種代謝物在結構上均含有N原子[26]，屬于親核型化合物，因此在正離子模式下，更趨向于生成穩定的[M+H]+母離子，在流動相中加入甲酸作為質子供體，可提高一級母離子的質譜響應，另外加入甲酸銨可增大流動相離子強度，改善峰型。4種目標物標準溶液分別在混合流動相的情況下，以流動注射的方式對母離子及各子離子進行掃描，逐步優化母離子和各個子離子的去簇電壓（declustering potential，DP）和碰撞能量（collision energy，CE）等參數條件，以到達最大響應，最終選取響應最高的子離子作為定量離子，響應次之的作為輔助定性離子。具體定量離子的提取離子流圖和質譜參數分別見圖1和表1。

表1 4種目標化合物的質譜分析參數Table 1 Mass spectrometry parameters of 4 targeted compounds

圖1 4種目標化合物的UPLC-MS/MS總離子流色譜圖Fig.1 UPLC-MS/MS total ion flow chromatograms of 4 targeted compounds

2.2 茚嗪氟草胺及其代謝物的質譜裂解途徑分析

根據茚嗪氟草胺及其代謝物的質譜碎片響應強度，可確定4種目標化合物在質譜中形成的主要碎片為m/z158和m/z138，4種目標化合物均選擇這兩個碎片作為定量離子。在二級質譜碰撞電壓的轟擊下，三嗪環上的仲胺基-NH所連接的C-N鍵斷裂，三嗪環上的N結合H+形成帶正電荷，質荷比為m/z158和m/z138的碎片通過四極桿，其余部分帶負電或作為中性粒子丟失，而部分m/z158的碎片進一步丟失一分子的F和H，形成雙鍵，繼續產生m/z138的碎片。具體途徑見圖2。最終，以化合物的母離子和響應最高的兩個子離子的質荷比，結合出峰時間進行定性。

圖2 4種目標化合物的質譜裂解途徑Fig.2 Mass spectrometry fragmentation pathways of 4 targeted compounds

2.3 凈化劑的種類選擇及用量優化

實驗前期先使用100 mg的PSA、GCB、C18和Al-N對4種目標物的標準溶液進行吸附，以考察不同的固相萃取劑對4種目標物的吸附程度，結果見圖3。由圖3可知，C18和Al-N對4種目標物的吸附效果較小，但Al-N相對于C18，對1-氟乙基三嗪二胺的吸附仍然較大，回收率只有57.6%，而C18處理后，4種目標物的回收率均在88%～102%之間，因此C18作為固相萃取劑進行進一步的用量優化。

圖3 不同萃取劑對4種目標化合物回收率的影響（n=6）Fig.3 Effect of different extractants on recovery rate of 4 targeted compounds (n=6)

分別使用50 mg、75 mg、100 mg、125 mg、150 mg的C18固相萃取劑進行實驗，重復6次平行樣品，結果見圖4。由圖4可知，當用量＜100 mg時，4種目標物回收率較低，可能是由于凈化不充分，分析結果受到雜質的影響，從而回收率變低。而當用量＞100 mg之后，回收率變化不明顯，說明C18使用量在100～150 mg之間，不會對目標物產生明顯的吸附，為了降低檢驗成本，最終選擇100 mg為凈化用量。

圖4 不同C18用量對4種目標化合物回收率的影響（n=6）Fig.4 Effect different of C18 dosage on recovery rate of 4 targeted compounds (n=6)

2.4 乙腈用量對回收率的影響

在C18用量為100 mg的條件下，以啤酒作為實驗樣品，選擇5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL乙腈進行提取實驗，以對應體積空白基質液配得的基質曲線進行校正，以確保基質效應不會因乙腈稀釋而變化，最終回收率作為考察依據。結果表明，乙腈用量為10 mL時，回收率達到分析測定要求，當用量繼續增大，回收率變化不明顯，綜合考慮操作便捷性和耗材成本，最終選取10 mL為最佳乙腈用量。

2.5 基質效應分析

由于啤酒經小麥發酵而制得，因此啤酒中含有大量的氨基酸、多肽、酒精和還原糖等小分子物質，在離子化的過程中會產生較強的基質效應（matrix effect，ME）。實驗分別使用空白基質溶液和乙腈按照1.3.1的方法配制標準曲線于儀器測定。以ME值計算公式：（k1/k2-1）×100%計算基質效應程度，其中k1為基質曲線斜率，k2為純溶劑曲線斜率，結果見表2。由表2可知，4種目標化合物基質均呈負效應，且抑制率遠超過-20%，抑制效應明顯，因此需要使用基質曲線進行定量計算。

表2 4種目標化合物的基質效應值Table 2 Matrix effect value of 4 targeted compounds

2.6 線性方程、方法檢出限和定量限

按照1.3.2的前處理方法處理空白樣品，所得空白基質液配制基質曲線，質量濃度范圍為1.0～50 μg/L。在優化后的儀器條件下進行測定，以質量濃度為橫坐標（X）和峰面積為縱坐標（Y）采用Excel 2016軟件中擬合曲線方程，并得出相關系數R2。結果表明，相關系數R2均大于0.999，說明線性關系較好，曲線能準確定量。同時通過低濃度的加標實驗，以信噪比3倍（S/N=3）和信噪比10倍（S/N=10）確定方法檢出限（LOD）和定量限（LOQ），4種目標化合物的LOD為2.0 μg/kg，LOQ為5.0 μg/kg，方法整體靈敏度較高，滿足一般產品除草劑殘留量的檢測需求，具體線性方程和靈敏度參數見表3。

表3 4種目標化合物線性方程及靈敏度參數Table 3 Linear equations and sensitivity parameters of 4 targeted compounds

2.7 加標回收率試驗及精密度試驗

選取市售啤酒作為加標實驗樣品，以4種目標化合物的方法定量限為基準進行1、2、10倍水平的添加，每個水平日內重復6個平行樣品測定，計算出相應的回收率和相對標準偏差。結果見表4。由表4可知，4種目標化合物的平均回收率為85.4%～98.1%，精密度試驗的相對標準偏差（RSD）為2.29%～4.55%，結果說明方法的回收率高，重現性較好，可用于日常檢測中。

表4 4種目標化合物的加標回收率和精密度實驗（n=6）Table 4 Standard recovery rate and precision test of 4 targeted compounds (n=6)

2.8 方法實際應用

實驗隨機選取實驗室日常啤酒樣品（進口樣品10個，國內樣品10個）進行測定，結果均未檢出。但在2017年，美國環保署分別對茚嗪氟草胺的毒理性和致癌性開展了風險評估，其中結果認為干啤酒花中，茚嗪氟草胺的使用限量為0.06 mg/kg。因此，本方法可為后續的分析測定方法開發提供技術儲備。

3 結論

實驗基于分散固相萃取技術結合UPLC-MS/MS建立了啤酒中茚嗪氟草胺及其3種代謝物的分析方法。通過C18固相萃取劑對提取液進行凈化，降低了啤酒中雜質對目標物的基質效應，同時提高了回收率，最終結果使用基質曲線進行校正。結合超高效液相色譜和優化的流動相配比，茚嗪氟草胺及其3種代謝物在2 min內完成出峰，且峰型良好。加標回收實驗結果表明，準確度和精密度較高，為啤酒中除草劑檢測方法的開發與研究提供了一定參考依據。