蔬菜水果中腐霉利快速檢測方法的優化

泮秋立，劉建華，張鴻雁，王 駿，，胡明燕，梁秀清，胡 梅*

（1.山東省食品藥品檢驗研究院 國家市場監管重點實驗室（肉及肉制品監管技術），山東 濟南 250101；2.山東師范大學 生命科學學院，山東 濟南 250101）

腐霉利（procymidone，PCD）是一種低毒的殺菌劑，又名殺霉利、二甲菌核利、速克靈等，通過抑制菌絲頂端細胞壁合成殺死霉菌，被廣泛用于蔬菜及果樹的灰霉病防治[1-3]。研究表明，腐霉利可以在植物上蓄積，少量攝入體內對人的身體沒有影響，但長期超標食用，會影響人體健康，輕則刺激眼部和皮膚，重則可能在人體內定量沉積，對人體的神經、血液系統等造成危害[4-6]。國家衛健委、農業農村部及市場監管總局聯合發布的GB 2763—2021《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》中明確規定了腐霉利在蔬菜水果中的使用范圍和最大殘留限量。但近年來，腐霉利在果蔬上的廣泛使用，仍使其成為農藥殘留檢出率和超標率較高的農藥品種之一。2019年以來，在國家市場監管總局和各省市抽檢通報中[7]，多次出現果蔬中腐霉利超標的問題，因此，蔬菜水果中腐霉利的監控檢測尤為重要。

腐霉利常用的檢測方法主要為儀器檢測法和免疫分析法。儀器檢測法主要包括氣相色譜法[8-9]、氣相色譜-質譜聯用法[10-11]和高效液相色譜法[12]等。現行國標方法中腐霉利的檢測方法為氣相色譜和氣相色譜-質譜聯用法。免疫分析法主要包括膠體金免疫層析法[13]和酶聯免疫法[14]等。儀器檢測法靈敏度高、重現性好，也是現階段我國監控食品安全的常用方法，但前處理復雜，耗時、耗力，專業性強，檢測成本高[15]。免疫分析法是基于抗原抗體之間特異性結合的原理來測定農藥殘留的方法，具有簡便、快速、成本低的優點，適合大量樣品的初步篩選和現場檢測[16]，其中又以膠體金免疫層析法應用最為廣泛[17-20]。

將儀器檢測法和免疫分析法結合，先用膠體金免疫層析法對大批量樣品進行快速篩檢，然后用儀器檢測法對陽性樣本進行確證，可大大縮短檢驗時間，減少人力、物力投入，提高檢驗效率[21-23]。目前市場上已有約上百家腐霉利快速檢測試紙條生產企業，但是由于不同品牌結果判讀、儀器性能差異、匹配的試劑來源不一、結果的判定存在差異等原因，腐霉利農藥殘留快速檢測技術在實際應用過程中出現了很多問題[24-25]。本研究通過優化主流腐霉利快檢產品的前處理步驟，確定檢測方法的性能指標，考察每種膠體金快檢產品在果蔬基質樣品檢測中的靈敏度、特異性、假陽性率、假陰性率和交叉反應，建立一種蔬菜水果中腐霉利的膠體金免疫層析快速檢測方法。旨在為基層監管部門快速篩查和農貿市場、餐飲單位、超市等把關蔬菜水果的進貨提供快捷有效的方式。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蔬菜、水果樣品：購自濟南某大型超市，且經參比方法GB 23200.113—2018《食品安全國家標準植物源性食品中208種農藥及其代謝物殘留量的測定氣相色譜-質譜聯用法》（定量限為0.01 mg/kg）檢測均不含腐霉利；陽性樣品韭菜（樣品A）、黃瓜（樣品B）和葡萄（樣品C）經GB 23200.113—2018《食品安全國家標準植物源性食品中208種農藥及其代謝物殘留量的測定氣相色譜-質譜聯用法》測定的腐霉利含量分別為0.67 mg/kg、3.20 mg/kg、5.61 mg/kg。

乙腈（純度≥99%）：霍尼韋爾貿易（上海）有限公司；丙酮、甲醇、Tris（純度均≥99%）：國藥集團化學試劑有限公司；腐霉利、百菌清、福美雙、多菌靈、啶酰菌胺、乙烯菌核利、異菌脲、五氯硝基苯、三唑酮、三氯殺螨醇、丙溴磷農藥標準品（純度均≥99%）：曼哈格（上海）生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

MS204TS/02電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；MS 3漩渦混合器：德國IKA公司；XMTD-7000電熱恒溫水浴鍋：北京市永光明醫療儀器有限公司。

1.3 方法

本方法采用競爭抑制免疫層析原理。樣品中殘留的腐霉利經提取后與膠體金標記的特異性抗體結合，抑制抗體和試紙條中檢測線（T線）上抗原的結合，從而導致檢測線顏色深淺的變化。通過檢測線與控制線（C線）顏色深淺比較，對樣品中殘留的腐霉利進行定性判定。

1.3.1 樣品前處理

稱取3 g（精確至0.01 g）搗碎后的蔬菜、水果樣品于50 mL離心管中，加入9 mL提取液（Tris-鹽酸-10%甲醇緩沖液，pH 9.0），渦旋振蕩提取1 min，過濾后備用。

1.3.2 樣品中腐霉利提取條件的優化

（1）提取液的選擇

比較pH 9.0的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）、Tris-鹽酸緩沖液和Tris-鹽酸-10%甲醇緩沖液對不同樣品進行處理后膠體金試紙條的顯色效果，選擇最佳提取液。

（2）提取液pH的優化

比較當提取液pH分別為7.0、8.0、9.0時，對模擬陽性樣本進行測定后試紙條的顯色結果，選擇最佳的提取液pH。

（3）提取液中甲醇體積分數的優化

比較當提取液中甲醇體積分數分別為2%、4%、6%、8%、10%、12%時，對模擬陽性樣本進行提取后的加標回收率和試紙條的顯色效果，確定最佳的甲醇體積分數。

（4）樣品提取液處理方式的優化

比較將不同樣品提取后的樣液分別經靜置、離心和過濾處理后試紙條的顯色效果，重復處理測定3次，選擇最佳的處理方式。

1.3.3 檢出限測定

由于本方法為定性檢測，判斷結果為陰性或陽性的依據就是樣品基質的限量水平，GB 2763—2021《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》中規定了蔬菜水果中腐霉利的最大殘留限量，其中限量水平最低的基質為韭菜即0.2 mg/kg，因此確定本方法的最低檢出限為0.2 mg/kg。取不含腐霉利的韭菜空白基質樣品，制成腐霉利質量濃度為0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.4 mg/kg的模擬樣品，將空白樣品和模擬樣品按照上述樣品前處理方法和分析步驟進行處理，觀察試紙條的顯色效果。

1.3.4 試紙條測定

吸取待測液200 μL于金標微孔中，抽吸5～10次混勻，3～5 min后將試紙條插入微孔中，8～9 min后進行結果判定。

檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色深或顏色相當，表明樣品中腐霉利殘留量低于方法檢出限，判定為陰性；檢測線（T線）不顯色或檢測線（T線）顏色比控制線（C線）顏色淺，表明樣品中腐霉利殘留量高于方法檢出限，判定為陽性；控制線（C線）不顯色，表明操作不當或試紙條無效。

1.3.5 檢測方法學研究

（1）性能指標的測定

稱取以韭菜、黃瓜和葡萄為代表的空白基質樣品，制成腐霉利質量濃度為相應限量水平的0.5倍、1.0倍和2.0倍的盲樣樣品各50份，共計450份樣本，按照優化后的方法進行測定，鑒于GB 2763—2021《食品安全國家標準食品中農藥最大殘留限量》中黃瓜的腐霉利限量為2 mg/kg，葡萄的腐霉利限量為5 mg/kg，所以其樣品過濾液需稀釋后測定，考慮到不同品牌產品之間的差異，可參照廠家試劑盒說明書中的稀釋倍數進行稀釋后測定，以考察方法的靈敏度、特異性、假陽性率和假陰性率。

（2）交叉反應

在韭菜空白基質樣品中分別加入百菌清、福美雙、多菌靈、啶酰菌胺、乙烯菌核利、異菌脲、五氯硝基苯、三唑酮、三氯殺螨醇、丙溴磷等10種農藥，每種農藥質量濃度水平為最低檢出限的1 000倍即200 mg/kg，按照優化后的測定方法考察交叉反應。

（3）環境溫度的影響

利用腐霉利添加量為0.1 mg/kg、0.2 mg/kg的模擬樣品在10～40 ℃范圍進行環境溫度適應性考察，每份濃度樣品進行5次平行測試。

（4）與參比方法的一致性

稱取以韭菜、黃瓜和葡萄為代表的空白基質樣品，制成腐霉利添加量為相應限量水平的0.5倍、1倍和2倍的盲樣樣品各20份。分別用本研究建立的快速檢測方法和標準參比方法GB 23200.113—2018《食品安全國家標準植物源性食品中208種農藥及其代謝物殘留量的測定氣相色譜-質譜聯用法》進行檢測，對方法一致性進行考察。

（5）真實陽性樣品驗證

韭菜（樣品A）、黃瓜（樣品B）和葡萄（樣品C）腐霉利真實陽性樣品，經GB 23200.113—2018《食品安全國家標準植物源性食品中208種農藥及其代謝物殘留量的測定氣相色譜-質譜聯用法》測定的腐霉利含量分別為0.67 mg/kg、3.20 mg/kg、5.61 mg/kg，按照優化后的測定方法進行驗證。

2 結果與分析

2.1 提取液的選擇

選取經參比方法GB 23200.113—2018《食品安全國家標準植物源性食品中208種農藥及其代謝物殘留量的測定氣相色譜-質譜聯用法》檢測后的3個樣品：模擬陰性樣本1、模擬陰性樣本2和韭菜真實陽性樣本（樣品A）。對比考察了3種提取液（pH 9.0的PBS緩沖液、Tris-鹽酸緩沖液、Tris-鹽酸-10%甲醇緩沖液）對腐霉利農藥的提取效果，用膠體金試紙條平行測定3次，結果見表1。由表1可知，3種提取液對模擬陰性樣本1和模擬陰性樣本2的試紙條檢測結果均為陰性，與參比方法一致。樣品A分別經PBS緩沖液和Tris-鹽酸緩沖液提取后，試紙條測定結果與參比方法結果不一致；經Tris-鹽酸-10%甲醇緩沖液的提取后，試紙條測定結果與參比方法結果一致，試紙條結果重復性好。因此，選擇Tris-鹽酸-10%甲醇緩沖液為提取液。

表1 不同提取液對腐霉利的提取效果比較Table 1 Comparison of extraction effects of different extracts on procymidone

2.2 提取液pH的優化

圖1為模擬陽性樣本的試紙條測定結果。由圖1可知，試紙條C線顯色正常，T線顏色隨著提取液pH的增加由深變淺，當pH為9.0時，樣本的檢測結果為明顯陽性，C、T線顏色對比明顯，結果重復性好。因此，選擇提取液的pH值為9.0。

圖1 不同pH的提取液下模擬陽性樣本的試紙條測試結果Fig.1 Test results of test strip of simulated positive samples under different pH extracts

2.3 提取液中甲醇體積分數的優化

利用膠體金試紙條和參比方法GB 23200.113—2018《食品安全國家標準植物源性食品中208種農藥及其代謝物殘留量的測定氣相色譜-質譜聯用法》對比考察不同甲醇體積分數的提取液對模擬陽性樣品中腐霉利的提取效果，結果見表2。由表2可知，隨著提取液中甲醇體積分數不斷增大，回收率隨之增加。當甲醇體積分數為2%、4%和6%時，模擬陽性樣品的檢測結果為陰性；當甲醇體積分數為8%和12%時，試紙條測試結果重復性不好；當甲醇體積分數為10%時，回收率為77.8%，試紙條測定結果為陽性，且重復性好。因此，考慮到腐霉利加標回收率、試紙條顯色結果和環保低毒等要求，選擇提取液中甲醇體積分數為10%。

表2 不同甲醇體積分數對腐霉利試紙條的測試結果Table 2 Test results of different methanol volume fraction on procymidone test strip

2.4 樣品提取液處理方式的優化

選取經參比方法GB 23200.113—2018《食品安全國家標準植物源性食品中208種農藥及其代謝物殘留量的測定氣相色譜-質譜聯用法》檢測后的模擬陰性樣本和韭菜真實陽性樣本（樣品A），用試紙條進行測定。將樣品提取液分別經靜置、離心和過濾處理后試紙條的顯色結果見表3。由表3可知，三種不同處理方式，陰性樣本的測試結果與參比方法一致。樣品A的提取液經靜置或離心處理后，試紙條檢測結果存在檢出陰性的情況；經過濾處理后，試紙條檢測結果與參比方法檢測結果一致，重復性和穩定性好。考慮到本方法中樣品制備方式為搗碎，樣品比較細，為降低提取后的樣品液中基質對檢測結果的影響，保證檢測結果的準確性，選擇過濾的處理方式。

表3 不同樣液處理方式對試紙條顯色結果的影響Table 3 Effect of different liquid treatment methods on color development results of test strip

2.5 檢出限的測定

圖2為試紙條檢出限的測定結果，從左到右依次為空白基質樣品和腐霉利質量濃度分別為0.1 mg/kg、0.2 mg/kg、0.4 mg/kg的模擬樣品的平行檢測結果。由圖2可知，試紙條C線均顯色正常，T線顏色隨著腐霉利含量上升由深變淺，當腐霉利質量濃度為0.2 mg/kg時，T線顏色明顯弱于C線，為陽性結果，因此本方法的檢出限為0.2 mg/kg。

圖2 試紙條檢出限結果Fig.2 Detection limit results of test strip

2.6 產品方法性能指標的測定

由表4可知，韭菜、黃瓜、葡萄基質陽性樣品均檢出50個陽性結果，假陰性率均為0；韭菜、黃瓜、葡萄基質陰性樣品均檢出100個陰性結果，假陽性率均為0；優化后的檢測方法測定的不同基質樣品的靈敏度、特異性均為100%。上述性能指標均符合《食品快速檢測方法評價技術規范》（食藥監辦科[2017]43號）[26]的技術要求。

表4 方法性能指標的計算結果Table 4 Calculation results of the method performance indexes

2.7 交叉反應

選取與腐霉利用途相同或復配使用或與腐霉利結構相似以及比較容易檢出的10種農藥：百菌清、福美雙、多菌靈、啶酰菌胺、乙烯菌核利、異菌脲、五氯硝基苯、三唑酮、三氯殺螨醇、丙溴磷等，考察其與腐霉利是否會產生交叉反應，結果見圖3。

圖3 交叉反應試紙條顯色結果Fig.3 Color development results cross-reaction test strip

由圖3可知，當空白韭菜基質樣品中加入腐霉利濃度水平為檢出限的1 000倍（即200 mg/kg）時，試紙條顯色結果均為陰性。因此本方法試紙條與百菌清、福美雙、多菌靈、啶酰菌胺、乙烯菌核利、異菌脲、五氯硝基苯、三唑酮、三氯殺螨醇、丙溴磷10種農藥均無交叉反應。

2.8 環境溫度的影響

由表5可知，當環境溫度為15～35 ℃，測定5次的快檢結果與國標結果均相符，符合率為100%，因此，最佳環境溫度為15～35 ℃。

表5 溫度耐變性實驗結果Table 5 Experimental results of temperature resistance

2.9 與參比方法一致性分析

分別用本研究建立的快速檢測方法與參比方法GB 23200.113—2018《食品安全國家標準植物源性食品中208種農藥及其代謝物殘留量的測定氣相色譜-質譜聯用法》測定3種不同基質的果蔬陰性樣品和模擬陽性樣品。結果表明，依據《食品快速檢測方法評價技術規范》（食藥監辦科[2017]43號）的要求，兩種方法的符合率為100%，通過卡方檢驗得出χ2=0.8＜3.84，表明本方法與參比方法的陽性確證比率在95%的置信區間內沒有顯著性差異，能夠用于蔬菜水果中腐霉利的檢測。

2.10 真實陽性樣品驗證

利用膠體金試紙條對韭菜（樣品A）、黃瓜（樣品B）和葡萄（樣品C）的真實陽性樣品進行驗證，平行測定3次，結果見表6。

表6 真實陽性樣品驗證結果Table 6 Verification results of true positive sample

由表6可知試紙條檢測結果均為陽性，與參比方法檢測結果一致。

3 結論

選用韭菜、黃瓜、葡萄作為研究對象，通過對市場上主流腐霉利膠體金快速檢測產品進行方法優化和性能指標考察，結果表明，采用pH 9.0的Tris-鹽酸-10%甲醇緩沖溶液作為提取液，解決了單純緩沖液提取樣品中腐霉利提取不完全的問題，并通過對樣品提取液進行過濾處理，降低了基質對檢測結果的影響，保證了檢測結果的準確性。在優化的前處理條件下，腐霉利膠體金快速檢測方法的檢出限可以達到0.2 mg/kg。經過驗證，本方法各項性能指標均符合要求，即方法的靈敏度為100%、特異性100%、假陽性率為0、假陰性率為0；交叉反應結果顯示本方法試紙條與百菌清、福美雙、多菌靈、啶酰菌胺、乙烯菌核利、異菌脲、五氯硝基苯、三唑酮、三氯殺螨醇、丙溴磷均無交叉反應；與參比方法進行一致性分析比較，結果表明，本方法與參比方法的陽性確證比率在95%的置信區間內沒有顯著性差異，建立的方法可行。綜上所述，本研究建立的腐霉利快速檢測方法，可用于蔬菜水果中腐霉利的現場檢測，能有效保障蔬菜水果的安全性。