白細胞介素33對心肌梗死后巨核細胞增殖、生成血小板的影響

付雯雯 吳嘉賀 胡笑容 江 洪

心肌梗死(myocardial infarction, MI)是冠心病中最嚴重的一種類型，具有高發生率和高致死率。醫療救治水平的提高使首次心肌梗死后生存率達到90%以上。然而，心肌梗死的復發率仍居高不下，第1年內復發率高達17.4%[1]。多項臨床研究發現，心肌梗死的復發與患者新生血小板計數增加密切相關。血小板內富含各種炎性細胞因子、血小板源性生長因子和血栓素。血小板被激活后通過釋放這些活性顆粒，促進炎性細胞向動脈粥樣硬化斑塊內浸潤、遷移和增殖，加重動脈粥樣斑塊炎性反應，甚至導致斑塊破裂，從而導致心肌梗死復發[2]。追尋血小板計數增加的機制發現，心肌梗死后骨髓巨核祖細胞數量、巨核細胞數量和成熟度均增加，形成血小板前體數量增多，而且巨核細胞在空間分布上更貼近血管內皮[3]。這些結果提示，巨核細胞增殖、發育以及生成血小板計數增加。進一步探索干預心肌梗死后骨髓巨核細胞增殖發育以及血小板過度生成的機制對于改善心肌梗死預后具有重要意義。

白細胞介素33(interleukin-33, IL-33)是屬于IL-1家族的一種炎性細胞因子，主要表達于人類血管內皮細胞，以及胃腸道和肺氣道上皮細胞。IL-33在心肌細胞中亦有表達。有研究表明，IL-33對動脈粥樣硬化有保護作用。額外給予IL-33，可延緩ApoE-/-小鼠的動脈粥樣硬化進展，體現在冠狀動脈管腔狹窄的嚴重程度有所減輕，以及保護性炎性細胞因子釋放增加，包括IL-4、IL-5和IL-13[4]。另外，IL-33對心肌梗死早期炎性反應也有減輕作用。但另有研究表明，IL-33信號可能具有有害作用。急性心肌梗死后，心臟組織IL-33水平升高。心肌梗死小鼠接受IL-33注射后，出現心臟功能惡化、心室重塑加重等不良結果。同時，IL-33還導致小鼠心肌梗死面積增加，加重心肌細胞死亡以及心臟破裂致死率[5]。而心肌梗死后的巨核細胞增殖與血小板過度生成可加重心肌梗死預后[3,6,7]。關于IL-33是否影響心肌梗死后巨核細胞增殖以及生成血小板，目前尚不清楚。本研究旨在探討IL-33對心肌梗死后骨髓巨核細胞增殖、生成血小板的影響。

材料與方法

1.實驗動物：SPF級C57BL6雄性小鼠，9～11周齡，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[實驗動物許可證號：SCXK(京)2016-0006]。所有小鼠飼養于SPF環境中，保證飲食、清潔。實驗過程嚴格按照武漢大學以及武漢大學人民醫院動物實驗規章制度執行。

2.抗體與試劑：CD41-FITC抗體、VE-Cadherin抗體購自美國eBioscience公司，CD42-APC抗體購自美國Biolegend公司。IL-33蛋白購自英國Abcam公司。血小板生成素(thrombopoietin,TPO) ELISA試劑盒購自美國R&D Systems公司。

3.心肌梗死模型的建立： C57BL6小鼠經3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，后背位固定，氣管插管連接小動物呼吸機，頻率120次/分鐘，潮氣量150μl。連接多導儀，持續記錄心電圖、心率變化。緊靠胸骨正中于左側第4肋間打開胸腔，暴露心臟，剪開心包膜，于左心耳與肺動脈圓錐中點至心尖連線中上1/3處用穿有8-0縫合線的彎針勾繞并結扎冠狀動脈左前降支(left anterior descending,LAD)，造成心肌梗死，以心電圖Ⅱ導聯ST段抬高以及心肌表面局部由紅潤變成發紺，則心肌梗死模型成功。逐層縫合胸腔，麻醉復蘇。

4.IL-33蛋白預處理：IL-33處理組小鼠經腹腔注射IL-33蛋白(50μg/kg)連續14天，對照組小鼠腹腔注射同等劑量磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)連續14天。然后兩組小鼠分別進行心肌梗死造模。

5.骨髓免疫熒光染色：3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉小鼠后，頸椎脫臼處死小鼠，取股骨經4%多聚甲醛浸泡固定后，液氮凍存。冷凍切片機切割直至骨髓充分暴露，室溫放置片刻后取出骨組織，進行免疫熒光染色。分別使用CD41-FITC與CD42-APC孵育標記。染色完畢后，用高分辨率共聚焦熒光顯微鏡進行成像，統計圖像中巨核細胞數量以及生成的血小板前體數量。CD41+CD42+標記成熟巨核細胞，CD41+CD42-標記未成熟巨核細胞。

6.流式細胞術：分離提取小鼠原代骨髓細胞，加入CD41-FITC (5微升/106個細胞)與CD42-APC(5微升/106個細胞)孵育30min后，洗去抗體。采用美國BD公司流式細胞儀檢測CD41+CD42+細胞與CD41+CD42-細胞數量，Flowjo軟件分析數據。

7.血小板計數：經小鼠尾靜脈抽取50～70μl經ETDA抗凝血，用全血細胞計數儀檢測血小板計數。

結 果

1.IL-33處理對MI小鼠循環血液中血小板計數的影響：心肌梗死造模1天和3天后，IL-33處理組小鼠的血小板計數與對照組比較，差異無統計學意義，這提示IL-33對心肌梗死后血小板生成無顯著影響(圖1)。

圖1 IL-33處理對心肌梗死小鼠血小板計數的影響

2.IL-33處理對MI小鼠骨髓巨核細胞的影響：心肌梗死造模3天后，免疫熒光染色檢測IL-33處理組小鼠骨髓成熟巨核細胞(CD41+CD42+)與未成熟巨核細胞(CD41+CD42-)數量均高于對照組。同樣的，采用流式細胞術檢測也發現IL-33處理組小鼠骨髓成熟巨核細胞與未成熟巨核細胞占全骨髓細胞的比例升高，這提示IL-33處理使心肌梗死后骨髓內巨核細胞增多(圖2中A～F)。

3.IL-33處理對MI小鼠骨髓中血小板前體(proplatelet)的影響：心肌梗死造模3天后，采用免疫熒光染色發現，IL-33處理組小鼠骨髓巨核細胞生成的血小板前體數量與對照組比較未見明顯變化。血小板前體為巨核細胞胞質延長的偽足樣結構，伸入血管竇，末端脫落形成血小板，因此可代表巨核細胞生成血小板能力。這一結果進一步提示IL-33不影響心肌梗死后的血小板生成(圖2G)。

圖2 IL-33處理對心肌梗死小鼠成熟巨核細胞和未成熟巨核細胞的影響

4.IL-33處理對MI小鼠血清TPO水平的影響：TPO是目前已知最強效的促巨核系增殖與血小板生成的因子[8]。筆者采用ELISA檢測小鼠血清TPO水平，發現IL-33處理組與對照組差異無統計學意義，這提示IL-33不影響小鼠血清TPO水平(圖3)。

圖3 IL-33處理對心肌梗死小鼠血清TPO水平的影響

討 論

IL-33是一種介導免疫應答的炎性細胞因子，在炎癥、感染等刺激下，IL-33作為一種內源性危險信號，在細胞損傷或壞死后釋放，促進免疫細胞的募集以及組織修復，在機體固有免疫與適應性免疫中發揮重要作用[9～12]。除了誘導促炎性反應外，IL-33還通過啟動Th2型免疫反應在同種異體移植物存活期間發揮關鍵作用，以及促進中性粒細胞募集和吞噬以對抗嚴重膿毒癥[13]。IL-33的受體是ST2(suppression of tumorigenicity 2)。IL-33通過與ST2受體結合，進而與IL-1受體輔助蛋白結合，激活包括MYD88、IRAK1、IRAK4、TRAF6在內的信號蛋白復合物形成，從而激活NF-κB和有絲分裂原活化蛋白激酶(ERK、p38和JNK)等信號通路，誘導免疫細胞的增殖、存活、遷移，并促進IL-4、IL-5和IL-13等炎性細胞因子以及一些趨化因子的釋放[14, 15]。心肌梗死后，一系列免疫細胞以及免疫因子被激活，其中包括IL-33，其在心肌梗死后表達升高[5]。關于IL-33對心肌梗死預后有利還是有害，目前尚有爭議。體外給予IL-33可延緩ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化進展，表明IL-33對心血管疾病有保護作用。但也有研究發現，IL-33可致心肌梗死小鼠心臟功能惡化。

因血小板在動脈粥樣硬化發生、發展過程中起重要作用，本研究從另一個角度出發，探討IL-33對血小板生成的作用。血小板由巨核細胞產生。近年來研究發現，IL-33可以調控巨核細胞的免疫分化，使巨核細胞具有類似免疫調節細胞的表型[16]。然而尚無研究表明，IL-33是否可以影響巨核細胞增殖、分化與血小板生成。既往的研究結果也未發現IL-33有直接促進MK生成血小板的作用。本研究發現，IL-33使心肌梗死小鼠骨髓內巨核細胞與巨核祖細胞的數量增多，但血小板計數無明顯變化，TPO水平也無改變。這提示IL-33可能通過不依賴TPO的途徑促進心肌梗死后骨髓巨核細胞增殖，但不影響血小板生成。

因時間、材料有限，本研究暫未進一步探討IL-33促進巨核細胞增殖的機制。有研究發現，IL-33受體ST2表達于造血干、祖細胞表面[17,18]。ST2-/-小鼠與野生型小鼠比較，其骨髓中，粒系-巨噬系、紅系和多潛能祖細胞數量都有所減少，同時，這些細胞的增殖能力也有所降低，這提示IL-33/ST2有促進骨髓造血干、祖細胞增殖的作用[18]。本研究發現，IL-33對心肌梗死小鼠巨核細胞增殖有促進作用，與既往研究結果相符合。在哮喘患者中，IL-33可誘導骨髓來源的CD34+造血祖細胞向基質衍生因子-1α(stromal derived factor-1α, SDF-1α)梯度遷移[19]。因此，IL-33也可能通過促進造血干、祖細胞遷移至SDF-1α高濃度的血管龕周圍，從而促進巨核細胞增殖與分化，使巨核細胞數量增多。

綜上所述，本研究發現IL-33可促進心肌梗死后小鼠骨髓中巨核細胞增殖，但不影響其生成血小板，對于深入理解心肌梗死后IL-33對骨髓造血系統產生的影響具有一定意義。心肌梗死后血小板的過度生成是造成心肌梗死不良預后的重要原因之一[20]。因此，本研究結果提示，IL-33可能不通過干擾血小板生成來影響心肌梗死預后。