miR-181b-5p負調控CYLD的表達促進膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲

朱 奕 李世豪 劉宏偉

膀胱癌(bladder cancer，BCa)是人類泌尿生殖系統最常見的惡性腫瘤之一[1]。2020年全球癌癥數據顯示，BCa新發病例約573000例，死亡病例約213000例[2]。高齡、吸煙、感染、接觸致癌物和部分職業暴露等均是BCa發生的危險因素[3]。BCa的發生、發展是一個多因素、多階段、多機制的過程，其發病機制尚未完全闡明。目前針對BCa的治療包括手術治療、放化療、免疫治療等，但總體治愈率仍不理想[4, 5]。因此，了解BCa發生的分子機制，發掘其潛在的治療靶點對BCa的臨床治療至關重要。

microRNA(miRNA)是一類長度約為20～23個核苷酸的內源性小RNA，在調節腫瘤細胞生長、增殖、分化、凋亡和代謝等方面發揮重要作用[6,7]。miR-181b-5p在多種腫瘤中異常表達，并且在不同的腫瘤中表現出雙重特性，既可以作為癌基因，也可以作為抑癌基因。例如，miR-181b-5p在非小細胞肺癌和乳腺癌中表達均上調，具有成為肺癌和乳腺癌診斷標志物的潛力[8, 9]。miR-181b-5p在腦膠質瘤細胞中表達下調，作為抑癌miRNA靶向下游Bcl-2基因，增強膠質瘤對替莫唑胺的化療敏感度[10]。這表明miR-181b-5p在調節腫瘤發生、發展中的作用具有組織特異性，然而miR-181b-5p在BCa中的作用尚未闡明。

抑癌基因Cylindromatosis(CYLD)是 USP 去泛素化酶家族的成員，其翻譯產物是一種去泛素化酶，具有從特定底物中去除多聚泛素鏈的強大能力，能夠通過去泛素化調控Wnt/β-catenin、TGF-β、NF-κB和JNK等信號通路[11]。CYLD突變或表達失調是包括癌癥在內的多種疾病發生的重要因素。例如，CYLD的表達在鼻咽癌組織和細胞中均顯著降低，過表達CYLD能夠通過泛素-蛋白酶體途徑抑制抑癌因子NDRG1泛素化和降解，上調NDRG1水平，抑制鼻咽癌的進展[12]。研究表明，通過小干擾 RNA沉默CYLD或促癌 miRNA 下調 CYLD的表達，胃癌、膀胱癌、肺癌、結直腸癌等多種癌細胞遷移和轉移能力增加[11]。

本研究探討miR-181b-5p在BCa細胞中的作用及對CYLD的靶向調控作用，期待為BCa治療提供新的靶點。

材料與方法

1.細胞株及實驗材料：人膀胱尿路上皮癌細胞株(T24、UM-UC-3、5637)和人膀胱上皮永生化細胞(SV-HUC-1)購自中國科學院細胞庫(上海)；RPMI-1640培養基、DMEM培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司；miR-181b-5p 模擬物和CYLD siRNA由蘇州吉瑪基因股份有限公司設計合成。miR-NC sense：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，miR-NC antisense： 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′；miR-181b-5p模擬物 sense：5′-AACAUUCAUUGCUGUCGGUGGGU-3′，miR-181b-5p模擬物 antisense：5′-CCACCGACAGCAAUGAAUGUUUU-3′；si-CYLD-1 sense：5′-GGGCUUGCAAUGUAUGAGUTT-3′，si-CYLD-1 antisense：5′-ACUCAUACAUUGCAAGCCCTT-3′；si-CYLD-2 sense：5′-GGUUCAUCCAGUCAUAAUATT-3′，si-CYLD-2 antisense：5′-UAUUAUGACUGGAUGAACCTT-3′；Lipofectamine RNAimax轉染試劑購自美國Invitrogen公司；Opti-MEM培養基購自美國Thermo Fisher公司；Transwell小室購自美國Corning公司；CCK-8試劑盒購自日本Dojindo公司；RNAiso Plus，PrimeScript反轉錄試劑盒和TB Green premix Ex Taq試劑盒購自日本TaKaRa公司。miRNA熒光定量PCR試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。Dual-LumiTM雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒和SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，CYLD和GAPDH抗體購自美國Proteintech公司。

2.細胞培養與轉染：T24、5637和UM-UC-3細胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素溶液的RPMI-1640或DMEM培養基中培養，SV-HUC-1細胞在含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的F-12K培養基中培養。放置于5% CO2濃度、37℃的恒溫培養箱內，待細胞處于生長對數期進行實驗。轉染前1天，將T24和UM-UC-3細胞鋪于6孔板內，每孔2×105個。待次日細胞生長融合至孔板面積70%～80%，按照轉染試劑說明書進行轉染，分為對照組和miR-181b-5p組以及對照組、CYLD-1組、CYLD-2組。

3.RNA提取和qRT-PCR：將T24、UM-UC-3、5637和SV-HUC-1細胞鋪于6孔板內，24h后提取各細胞系的總RNA并測定濃度。在T24和UM-UC-3細胞中分別轉染對照組、miR-181b-5p組和CYLD-1組、CYLD-2組，24h后提取各組的總RNA并測定濃度，按照反轉錄試劑盒說明書將總RNA反轉錄合成cDNA。miRNA定量PCR檢測所需引物采用加尾法設計，miR-181b-5p上游引物：5′-AACATTCATTGCTGTCGGTGGGT-3′，下游引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。內參U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；CYLD上游引物：5′-GCCTCCCAAACTTGCCTTTA-3′，CYLD下游引物：5′-TGGATTGTGGTTGTGAGTCAA-3′；GAPDH上游引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，GAPDH下游引物：5′- GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。實時熒光定量PCR結果采用2-ΔΔCt統計分析。

4.CCK-8實驗：轉染24h后，待T24和UM-UC-3細胞處于生長對數期，將各組細胞消化離心后重新懸浮為單個細胞，以每孔1×103個細胞接種于96孔板內，每組設置3個復孔，放置于5% CO2濃度、37℃的恒溫培養箱內培養。在第0～5天同一時間點向每孔加入10μl CCK-8試劑，然后繼續在培養箱內放置2h，使用酶標儀檢測波長為450nm時各孔的吸光度(A)值，Graphpad prism 8軟件繪制細胞增殖曲線。

5.克隆形成實驗：轉染24h后，待T24和UM-UC-3細胞處于生長對數期，將各組細胞胰酶消化離心后重新懸浮為單細胞，以每孔500個細胞接種于6孔板內，每組設置3個復孔，放置于5% CO2濃度、37℃的恒溫培養箱內培養7～10天。期間多次觀察，待細胞集落形成，吸掉舊培養基，多聚甲醛固定、結晶紫染色，放在自來水下緩慢沖洗掉結晶紫，等待6孔板自然干燥后拍照。

6.Transwell遷移實驗：取轉染24h后處于對數生長期的T24和UM-UC-3細胞，胰酶消化細胞并用無血清培養基重懸后計數，在24孔板下室中加入600μl血清濃度為10%的完全培養基，將Transwell小室放置于24孔板內，小室內加入200μl的細胞重懸液，每個小室8×104個細胞，然后置于培養箱中培養。T24和UM-UC-3細胞分別培養約18h和24h后將小室用多聚甲醛固定和結晶紫染色，然后放在自來水下緩慢沖洗小室，待小室干燥后在顯微鏡下隨機選取3個視野拍照并計數。

7.Transwell侵襲實驗：將凍存于-80℃的基質膠提前取出放置于4℃解凍。次日，按照基質膠和無血清培養基1∶5的比例配成稀釋液，將Transwell小室放在24孔板內，吸取50μl基質膠稀釋液鋪于小室內，置于培養箱內2～3h使之凝固。凝固后在下室加入600μl完全培養基，小室內加入200μl細胞重懸液，每個小室8×104個細胞。置于培養箱中繼續培養相應時間后取出，后續固定、染色步驟同上。

8.雙熒光素酶報告基因實驗：采用starbase在線數據庫預測miR-181b-5p潛在的靶基因CYLD以及結合位點，構建CYLD 3′-UTR雙熒光素酶野生型質粒wt-CYLD和突變型質粒mut-CYLD。將wt-CYLD和mut-CYLD與miR-181b-5p 模擬物和對照共轉染T24和UM-UC-3細胞。轉染24h后吸盡舊培養基，用PBS清洗細胞3次，然后按照說明書加入細胞裂解液，充分裂解后，取20μl樣品，加入100μl螢火蟲熒光素酶檢測試劑，混勻后室溫孵育5min，然后使用多功能酶標儀進行化學發光檢測，再加入100μl海腎熒光素酶檢測試劑，混勻后進行酶標儀化學發光檢測，根據測得值進行雙熒光素酶報告基因實驗后續分析。

9.Western blot法檢測：轉染48h后，提取對照組和miR-181b-5p組的總蛋白質并測定濃度，30μg蛋白加入SDS-PAGE凝膠孔中，電泳2h后轉移至PVDF膜，5%脫脂奶封閉1h，并在4℃條件下孵育一抗(CYLD抗體稀釋濃度為1∶1000，GAPDH抗體稀釋濃度為1∶10000)過夜。次日孵育二抗1h，然后進行化學發光與曝光，以GAPDH為內參，用Image-J軟件分析各組灰度值。

結 果

1.miR-181b-5p在膀胱上皮永生化細胞和BCa細胞中的表達情況：qRT-PCR檢測miR-181b-5p在SV-HUC-1細胞和T24、5637、UM-UC-3細胞中的表達水平。結果顯示，與SV-HUC-1比較，miR-181b-5p在T24、5637、UM-UC-3細胞中的表達水平明顯升高(P<0.05，圖1)。

圖1 miR-181b-5p在膀胱上皮永生化細胞和膀胱癌細胞中的表達水平

2.過表達miR-181b-5p促進BCa細胞增殖、遷移和侵襲：轉染miR-181b-5p 模擬物后，qRT-PCR驗證轉染效率。結果顯示，在T24和UM-UC-3細胞中，與對照組比較，miR-181b-5p組miR-181b-5p的表達水平顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01，圖2A)，提示轉染成功。CCK-8檢測過表達miR-181b-5p后對T24和UM-UC-3細胞增殖能力的影響，結果顯示，miR-181b-5p組的細胞增殖能力顯著高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，圖2中B、C)。細胞克隆形成實驗結果顯示，miR-181b-5p組的細胞集落數顯著多于對照組，差異有統計學意義(P<0.05，圖2中D、E)，表明過表達miR-181b-5p后，T24和UM-UC-3細胞的增殖能力顯著增強。Transwell遷移和侵襲實驗顯示，與對照組比較，miR-181b-5p組的細胞遷移和侵襲數目均增加，差異有統計學意義(P<0.05，圖2中F～I)。

圖2 過表達miR-181b-5p對BCa細胞增殖、遷移和侵襲的影響

3.miR-181b-5p與CYLD 3′-UTR結合負調控CYLD的表達：利用starbase在線數據庫預測miR-181b-5p與CYLD的3′-UTR含有互補的核苷酸序列(圖3A)，隨后構建了CYLD 3′-UTR雙熒光素酶野生型質粒wt-CYLD和突變型質粒mut-CYLD。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，在T24和UM-UC-3細胞中，與對照組+wt-CYLD組比較，miR-181b-5p組+wt-CYLD組的熒光素酶活性顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05，圖3B、C)。然而，miR-181b-5p組+mut-CYLD組的熒光素酶活性相較于對照組+mut-CYLD組無明顯變化(P>0.05)，提示miR-181b-5p 與CYLD 3′-UTR之間存在結合位點。為進一步驗證miR-181b-5p調控CYLD的表達水平，qRT-PCR結果顯示，與對照組比較，miR-181b-5p組的CYLD mRNA水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05，圖3D)。Western blot法實驗結果顯示，miR-181b-5p組的CYLD蛋白表達量較對照組顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01，圖3中E、F)。以上實驗結果表明，miR-181b-5p對靶基因CYLD有負性調控作用。

圖3 miR-181b-5p對靶基因CYLD的影響

4.沉默CYLD促進BCa細胞增殖、遷移和侵襲：沉默CYLD后，采用qRT-PCR驗證轉染效率。結果顯示，與對照組比較， CYLD-1組和CYLD-2組的CYLD表達水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01，圖4A)，提示沉默CYLD轉染成功。CCK-8結果顯示，沉默CYLD顯著促進膀胱癌T24和UM-UC-3細胞增殖，差異有統計學意義(P<0.05，圖4中B、C)。細胞克隆形成實驗結果顯示，與對照組比較，CYLD-1組和CYLD-2組細胞集落形成數目增多，差異有統計學意義(P<0.05，圖4中D～F)。Transwell遷移和侵襲實驗顯示，與對照組比較，CYLD-1組和CYLD-2組的細胞遷移和侵襲數目均增加，差異有統計學意義(P<0.01，圖4中G～J)。以上結果表明沉默CYLD能夠促進BCa細胞的增殖、遷移和侵襲能力。

圖4 沉默CYLD對BCa細胞增殖、遷移和侵襲能力的影響

討 論

BCa是泌尿生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，盡管近些年BCa的發生率和病死率呈下降趨勢，但仍嚴重威脅人們的生命健康[13]。隨著對BCa分子生物學的認識不斷提高，人們發現miRNA與BCa的發生、發展密切相關，以期從分子水平闡釋BCa的發病機制[14]。研究表明miRNA參與BCa的增殖、遷移、侵襲、遠處轉移和耐藥等多種生物學過程，甚至認為miRNA可作為BCa早期診斷和預后評估的重要標志物[15, 16]。研究發現，miR-181b-5p在胃癌患者血清和胃癌細胞中表達升高，下調miR-181b-5p的表達后可顯著抑制胃癌細胞的增殖[17]。此外，miR-181b-5p在非小細胞肺癌、乳腺癌、膽管癌、腦膠質瘤和結直腸癌中均有不同程度的異常表達[8～10,18,19]。然而，miR-181b-5p在BCa中的作用和機制尚不明確。

本研究比較了膀胱上皮永生化細胞和BCa細胞中miR-181b-5p的表達水平，結果顯示，miR-181b-5p在BCa細胞中的表達量顯著升高，表明miR-181b-5p可能參與了BCa的發生、發展。隨后，本研究進一步探討了miR-181b-5p在BCa中的生物學作用，采用體外轉染法過表達miR-181b-5p后，可顯著增加T24和UM-UC-3細胞的增殖、遷移和侵襲能力，表明miR-181b-5p在BCa中發揮明顯的促癌作用。miRNA通過堿基互補配對的方式結合到靶基因的3′-UTR，導致靶基因降解或翻譯抑制[20～22]。本研究采用生物信息網站starbase數據庫預測CYLD是miR-181b-5p的潛在靶基因。雙熒光素酶報告基因實驗證實miR-181b-5p能夠與CYLD的3′-UTR結合，過表達miR-181b-5p后在mRNA和蛋白質水平抑制CYLD的表達，進一步證明CYLD是miR-181b-5p的靶基因。

CYLD是一種去泛素化酶，在多種癌癥中屬于腫瘤抑制基因，其抑癌功能的喪失與胃癌、肺癌、結直腸癌和多發性骨髓瘤等多種腫瘤的發生相關[11, 23]。研究表明，CYLD在BCa組織和細胞系中的表達均下降，過表達CYLD后通過NF-κB信號通路抑制BCa細胞的增殖、遷移和細胞周期S期的聚集[24]。本研究發現沉默CYLD的表達后，BCa細胞的增殖、遷移和侵襲能力顯著增加，表明CYLD在BCa中起著抑癌基因的作用。

綜上所述，miR-181b-5p在BCa細胞系中表達下調，通過負調控CYLD的表達促進BCa細胞的增殖、遷移和侵襲。本研究在一定程度上闡述了miR-181b-5p與BCa發生、發展之間的關系，表明miR-181b-5p可能成為BCa治療的新靶點。