AAV9載體在小鼠體內分布的長期研究

化春曉 孫英杰 郭依琳 楊宇霞 孔祥東

杜氏肌營養不良(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是一種是由DMD基因突變引起的致命性的X連鎖隱性遺傳病，全球發生率約為(10.7～27.8)/10萬活產嬰兒[1]。DMD通過常規治療治愈非常困難，但因其致病基因非常明確，故該病特別適合于基因治療。腺相關病毒(adeno-associated virus，AAV)是DMD基因治療中最熱門的的載體之一，腺相關病毒9型(adeno-associated virus serotype 9，AAV9)是從非人靈長動物中分離出來的，免疫原性和毒性極低，可介導外源基因長期有效表達，在心肌、骨骼肌、腦、肝臟和胰腺等組織臟器中均具有較高的轉導效率[1,3]。Hakim等[4]觀察AAV9micro-dystrophin基因治療mdx小鼠的療效時發現，mdx小鼠全身骨骼肌功能顯著改善，并有劑量依賴效應。有研究證明，使用AAV9micro-dystrophin基因治療成年Duchenne型肌營養不良癥模型犬療效持久且安全，可廣泛表達于全身肌肉組織，顯著提高肌力、促進運動功能的恢復[5]。雖然AAV9載體應用于DMD基因治療的有效性已得到了證實，但病毒載體能否長期安全地發揮作用仍不清楚。因此，本研究通過觀察經肌內注射AAV9-Luc病毒小鼠體內的熒光表達情況，進而分析AAV9載體在小鼠體內的長期分布結果，并對小鼠主要肌肉組織內分布的病毒載體進行熒光定量分析。

材料與方法

1.材料：(1)實驗動物：于廣東省實驗動物監測所購入50只周齡為5周左右的雄性Balb/c nude小鼠，飼養于廣東省醫學實驗動物中心SPF級設施內[實驗動物許可證：SCXK(粵)2018-0044)]。小鼠體質量約17～20g，健康，無任何疾病。所有動物均符合實驗動物倫理要求，每日喂小鼠適量飼料，隨意飲水，光照及夜暗時間均為12h。飼養環境平均溫度、平均濕度均達到實驗動物飼養標準。(2)試劑：ssAAV-CMV--Luciferase-WPRE(AAV-Luc)病毒載體由筆者所在實驗室構建，由山東維真生物科技有限公司合成包裝。Luciferin溶液由筆者所在實驗室配制。(3)儀器：Xenogen IVIS 50動物活體成像系統由廣州市銳博生物科技有限公司提供。

2.實驗方法：(1)分組方法：50只Balb/c小鼠隨機分為A、B兩組，每組25只，A、B兩組又隨機各分為5個亞組，每組5只。(2)注射方式：A組為實驗組，每只給予4×1011vg 的AAV-Luc病毒50μl。B組為空白對照組，每組給予0.9% NaCl注射液50μl。A、B兩組注射方式相同，均為經右后肢肌內進行4點注射，單次給藥，且保證每只小鼠注射的量一致。(3)動物觀察指標：每天觀察A、B兩組小鼠并記錄其一般行為學表現，主要觀察的指標有：小鼠體質量變化、體溫、四肢運動情況、進食情況、排便情況、精神、神經、毛發顏色、分泌物，有無死亡、瀕死前反應等。具體觀察項與指征詳見表1。(4)小鼠活體熒光分布觀察及主要肌肉組織熒光定量：根據AAV9的藥效學和藥代動力學特性、受試動物及臨床研究方案等因素，分別于AAV9-Luc病毒注射后的第1、3、7、14、30天，從A、B兩組中各挑1個亞組，小鼠吸入麻醉后，向腹腔注射200μl底物熒光素，在IVIS 50活體成像系統下連續拍照，觀察小鼠全身的熒光表達情況。隨之快速處死小鼠，按照以下順序分離各組織器官(睪丸、腦、膈肌、肋間肌、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肺臟、胰腺、左前肢、右前肢、左后肢、右后肢)，在分離后的組織器官上均勻滴加配置好的Luciferin溶液，在顯色時間10min后置于IVIS 50活體成像系統下觀察熒光表達情況，并用儀器累計記錄小鼠右后肢肌、右前肢肌、肋間肌、心肌、膈肌組織平均Luc發光量，進行熒光定量分析。

表1 小鼠一般體征觀察項與指標

結 果

1.小鼠一般情況觀察：在注射AAV9-Luc病毒或0.9% NaCl注射液后至被處死之前的這段時間內，各小鼠生長狀況良好，體質量較前稍增加，體溫、大小便正常，食量無明顯變化，毛發有光澤，運動頻率正常且無異常運動，神經、精神良好，無嗜睡、驚厥等，無異常分泌物，無死亡、瀕死前反應。

2.小鼠全身熒光表達情況：30天內，對照組小鼠體內始終無熒光表達。實驗組小鼠經右后肢肌內注射AAV9-Luc病毒3天后，在體內各部分均可檢測到熒光表達(圖1)。隨著時間的延長，熒光表達量逐漸增大，表達部位先局限于右后肢注射處，后逐漸擴大(圖2)。

圖1 肌內注射AAV9-Luc 3天后小鼠各組織器官中熒光表達分布情況

隨時間的延長，觀察各組織器官中的熒光分布發現，第1天時僅在注射部位有熒光表達。第3天時可在右后肢、右前肢、左后肢、左前肢及膈肌等肌肉組織中表達。第7天時肌肉中熒光表達更為強烈，雙側腎臟有少量熒光表達。第14天時右后肢的熒光表達最為強烈，且未見除肌肉外其他器官有明顯熒光表達。第30天右后肢的熒光表達略低于第14天，但仍未見除肌肉外其他器官有明顯熒光表達(圖2、圖3)。

圖2 肌內注射AAV9-Luc后小鼠體內熒光表達分布隨時間的變化情況

圖3 肌內注射AAV9-Luc后小鼠各組織器官內熒光表達分布隨時間的變化情況

3.小鼠部分組織熒光定量分析：在注射后的第1、3、7、14、30天，對小鼠右后肢肌、右前肢肌、肋間肌、心肌、膈肌中的熒光表達量進行定量分析，小鼠右后肢肌的光子數分別為0.8×105、1.7×106、10.0×106、18.9×106、23.7×106；小鼠右前肢肌的光子數分別為0.1×103、2.5×104、6.0×104、16.2×104、25.3×104；小鼠肋間肌的光子數分別為0.1×103、0.3×104、1.8×104、5.0×104、4.0×104；小鼠心肌的光子數分別為0.1×103、0.3×103、2.8×104、5.0×104、4.0×104；小鼠膈肌的光子數分別為0.2×102、0.2×105、1.2×105、6.1×105、6.1×105，經分析可知右前肢肌、右后肢肌中的熒光表達量隨著時間的延長逐漸增大(圖4中A、E)。肋間肌、心肌、膈肌在注射后1～14天的熒光表達量逐漸增加，而在第14～30天時肋間肌和心肌的熒光表達量略下降(圖4中B、C)，膈肌的熒光表達量無明顯變化(圖4D)。

圖4 肌內注射AAV9-Luc后小鼠主要肌肉中病毒表達量隨時間的變化情況

討 論

DMD是最常見的X連鎖隱性遺傳性肌病，發生率約為1/5000的活產男嬰，有癥狀的女性攜帶者約為1/100000～1/45000，且無明顯的種族或地理差異[6]。典型的臨床特征是進行性肌萎縮、肌無力伴小腿腓腸肌假性肥大，隨著病情的加重可逐漸累及心肌和呼吸肌。患者血清肌酸激酶明顯升高，也可能會出現不同程度的語言延遲、學習障礙和認知障礙。多數患兒在7～13歲時喪失行走能力，多于20歲左右因心臟、肺臟衰竭而死亡[7]。臨床上可使用糖皮質激素來進行治療，長期使用可延長患者獨立行走的時間并改善患者的心肺功能[8]。但也會產生不良反應，包括肥胖、多毛、痤瘡、行為異常、免疫抑制、骨折和骨質疏松等[9,10]。臨床上還有一些物理療法，例如牽伸治療、應用矯形器、肌力訓練、有氧運動訓練以及物理因子治療等[11]。但這些方法只能緩解患者的癥狀，無法改變疾病的最終結局。

目前臨床上尚無根治DMD的方法，CRISPR/Cas基因編輯技術的出現有望徹底治愈DMD。目前基因治療的載體主要包括病毒和非病毒兩大類。非病毒載體，如脂質體和蛋白質多肽等，雖然較為安全但轉導效率低下，因此病毒載體的應用更為廣泛[12]。在過去幾年中，AAV作為CRISPR/Cas基因編輯系統的載體迅速推進了神經肌肉疾病基因治療的發展。AAV具有極低的免疫原性和細胞毒性，基本不產生免疫反應，宿主范圍廣泛，既能感染分裂細胞，又能感染非分裂細胞，可穩定地整合到人體細胞染色體上，介導外源基因在細胞內長期穩定表達，且不易被滅活[13,14]。

目前已經從人和動物組織中分離出了多種AAV血清型，包括至少12種自然存在的血清型和100多種變體，不同的血清型對不同的組織和細胞有不同的感染效率，但是尚未發現與任何已知疾病相關的AAV血清型[15,16]。有研究以AAV作為基因治療載體來轉運相應的凝血基因治療血友病，其治療效果可維持1年以上而且無毒性[17～19]。有研究以AAV作為載體攜帶含有特異乙型肝炎病毒的干擾RNA片段，可使乙型肝炎病毒的mRNA水平降低，從而減少體內的乙肝病毒而治療乙型肝炎，效果可長達數月[20]。Biferi等[21]用包含RPE65互補DNA片段的AAV載體對先天性黑蒙癥患者進行視網膜下注射，可改善部分患者的視功能。

在癌癥治療中，AAV可以向腫瘤細胞或腫瘤基質細胞內轉導癌癥治療基因，并使其穩定表達，從而有效抑制癌癥的進展[22,23]。AAV9特別適合作為DMD基因治療的載體，因其全身給藥后可高效地轉染各種器官的細胞，包括心肌、肝臟、骨骼肌、腦和脊髓等[2,3]。但AAV載體可能因體內潛在的免疫反應而不能長期表達，因此本研究通過肌肉向雄性Balb/c小鼠體內注射50μl劑量為4×1011vg/只的AAV9-Luc病毒，研究AAV9在小鼠體內的長期分布情況從而進一步評價AAV載體介導CRISPR/Cas9基因編輯系統臨床應用的安全性。

在本研究的30天內，對照組始終未檢測出任何熒光表達。實驗組小鼠活體觀察可見熒光一直局限于右下肢肌，雖然隨著時間的延長熒光表達范圍逐漸擴大，但可見熒光主要位于右下肢肌。為了觀察熒光在小鼠體內各器官組織的分布情況，在活體觀察熒光的大體分布后對小鼠進行了處死解剖，并分離出各個組織器官按照順序放好。在第3天時熒光主要集中在注射部位右下肢肌中表達，左下肢肌、心肌、膈肌有微量表達。隨后，筆者對各個器官中的表達量與時間關系進行了研究，結果顯示右后肢肌、右前肢肌中的熒光表達量隨著時間的增加逐漸增大。肋間肌、心肌、膈肌在注射后1～14天的熒光表達量逐漸增加，而在第14～30天時肋間肌和心肌的熒光表達量略微下降，膈肌的表達量無明顯變化。證明AAV9載體介導CRISPR/Cas9基因編輯系統臨床應用的安全性較高。

本實驗存在一些不足之處，本實驗中考慮DMD患者多為免疫功能正常的男性，采用了Balb/c雄鼠進行實驗，未來會進一步擴大樣本，采用雌性Balb/c或mdx小鼠進行實驗。本實驗中使用了Balb/c雄鼠，小鼠皮毛可能對觀察全身熒光表達存在一些影響，未來可采用Balb/c無皮毛的雌性裸鼠進行實驗。實驗在小鼠的注射后進行了持續30天的觀察，但有研究證明AAV9可以在小鼠體內存留數月，所以未來需進一步延長時間繼續觀察。

綜上所述，肌內注射AAV9，劑量為4×1011vg/只時，病毒在小鼠體內30天表達情況下局限分布于肌肉(右后肢肌、左后肢肌、膈肌、心肌、肋間肌)，而在非肌肉器官中幾乎沒有分布，具有很高的肌肉組織特異性，初步證明AAV9作為DMD基因治療的載體較為安全有效。