lncRNA RP11-1C8.5通過結合miR-181a-5p對糖尿病心肌細胞凋亡和增殖的影響

黃 銳 周 源 賀 清 白 楊 周禮平

糖尿病性心肌病是糖尿病患者的并發癥之一，其特征包括心室擴張、心肌纖維化、心臟肥大等心肌結構改變[1]。糖尿病性心肌病的發生可能與心肌細胞的凋亡、炎癥、代謝、氧化應激等相關，是導致糖尿病患者死亡的重要原因[2]。然而，糖尿病性心肌病的發病機制尚不清楚，確定糖尿病性心肌病的病理生理機制和潛在的治療靶點是其防治研究的重要方向。心肌細胞凋亡和功能下降是糖尿病心肌病形成的重要機制，阻斷心肌細胞凋亡并促進其活力對治療糖尿病心肌病具有重要臨床意義[3～5]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類RNA轉錄本，長度大于200個核苷酸[6]。雖然lncRNA沒有蛋白質編碼功能，但其能夠通過多種作用機制調控特定基因的表達和定位，在細胞的生理和病理過程發揮顯著的生物學功能[7～9]。lncRNA與糖尿病及其并發癥的是糖尿病研究領域的熱點[10]。RP11-1C8.5是一個尚未被報道研究的lncRNA，其基因含有一個外顯子，轉錄產物長度為4597個核苷酸。本研究通過檢測不同高糖濃度培養下的心肌HCM細胞中RP11-1C8.5的表達，旨在觀察RP11-1C8.5與高糖濃度的相關性，通過感染RP11-1C8.5干擾腺病毒，探討敲減RP11-1C8.5對心肌細胞凋亡和增殖的調控及可能的作用機制。

材料與方法

1.細胞系與主要試劑:人心肌細胞系HCM購自美國ATCC公司。胎牛血清和心肌細胞培養基購自美國Hyclone公司。RP11-1C8.5干擾腺病毒(干擾序列為ATGGCATTTACAGAATAACAAAT，結合位點為175～197)和對照重組腺病毒購自北京索萊寶科技有限公司。LipofectamineTM3000、CCK-8試劑盒購自美國Invitrogen公司。細胞凋亡試劑盒購自美國Thermo Fisher Scientific公司。miR-181a-5p mimic和NC mimic購自廣州銳博生物科技有限公司。RP11-1C8.5野生型和突變型雙熒光素酶報告基因pGL3質粒購自上海和元生物技術股份公司。一抗Bax、caspase3、Bcl-2、CED-9、GAPDH購自美國Millipore公司。

2.細胞培養和感染:在37℃、5%CO2的培養箱中，心肌細胞系HCM培養在含10%胎牛血清的心肌細胞培養基中，使用5.5、10.0、13.9、22.2、33.3mmol/L葡萄糖孵育處理24h，qPCR檢測RP11-1C8.5的表達水平。在33.3mmol/L葡萄糖培養的HCM細胞融合度為80%時，將RP11-1C8.5干擾腺病毒和對照重組腺病毒感染心肌細胞，培養箱繼續培養32h，進行后續實驗。

3.qPCR檢測:采用TRIzol法從人心肌HCM細胞中提取總RNA，加入反轉錄試劑進行反轉錄，合成后的cDNA進行qPCR反應。qPCR反應體系為0.5μg總RNA、1μl上游引物、1μl下游引物、5μl 5×SYBR Green。采用2-ΔΔCt方法計算RP11-1C8.5、miR-181a-5p相對表達水平。以GAPDH為內參檢測RP11-1C8.5的表達；以U6為內參檢測miR-181a-5p的表達。引物序列如下，miR-181a-5p正向引物:CGGCAACATTCAACGCTGT，反向引物:GTCCAGGCTCCGAGGTATTC；GAPDH正向引物:ACATCGCTGAGACACCATG，反向引物:TGTAGTTGAGGTCAATGAAGGG；RP11-1C8.5正向引物:GCCCAGAGTGTCCATTCACT，反向引物:CATCTCCTTCTGGGACTCCA。U6正向引物:CACGCTTGGGC-AGCACATATACT，反向引物:ACGCATCACGAATCTGCGTGTC。

4.流式細胞術檢測:胰酶消化收集對照組和實驗組HCM細胞，用預冷的1×PBS溶液洗4次，用配好的binding buffer結合緩沖液重懸HCM細胞，每100μl細胞懸液中加入Annexin V-FITC試劑5μl，避光染色3h。每100μl細胞懸液中加入PI試劑5μl，避光染色30min，通過流式細胞儀檢測兩組HCM細胞的凋亡率。

5. CCK-8法檢測:將對照組和實驗組HCM細胞制備成均勻的細胞懸液，將每組單細胞懸液以6×103個/孔接種于96孔板，培養箱中常規培養。在細胞接種后第1～5天分別終止培養，加入30 微升/孔CCK-8試劑，搖床混勻，在培養箱中孵育3.5h。采用全自動酶標儀測定每孔在450nm波長處的吸光度(A)值，即HCM細胞相對活力。

6.生物信息學方法預測和雙熒光素酶報告基因實驗:根據生物信息學軟件starBase v2.0預測的RP11-1C8.5與miR-181a-5p的結合序列，將此野生型序列及突變型序列插入pGL3質粒構建雙熒光素酶報告基因質粒。將復蘇的HCM細胞鋪至24孔板，分別共轉染200ng RP11-1C8.5-wt、200ng RP11-1C8.5-mut或200ng NC mimic、200ng miR-181a-5p mimic。24h后收集細胞，分別檢測螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶發光強度，兩者比值即可反映RP11-1C8.5與miR-181a-5p相互結合的能力。

7. Western blot法檢測:向對照組和實驗組HCM細胞中加入細胞裂解液，低溫裂解30min，離心提取蛋白上清液。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和硝酸纖維素膜轉膜，采用4%脫脂牛奶進行封閉。加入所需監測蛋白的抗體，稀釋比例如下，一抗Bax(1∶5000)、caspase3(1∶3000)、Bcl-2(1∶3000)、CED-9(1∶3000)、GAPDH(1∶5000)，4℃過夜孵育。加入相應二抗(1∶9000)，室溫孵育3h，通過ECL發光試劑盒進行顯影。

結 果

1.RP11-1C8.5在高糖培養心肌細胞中的表達:qPCR結果顯示，與正常葡萄糖濃度(5.5mmol/L)比較，10.0、13.9、22.2和33.3mmol/L葡萄糖濃度培養基培養的心肌HCM細胞中RP11-1C8.5表達顯著上調(P<0.01)，RP11-1C8.5表達與葡萄糖濃度梯度呈正相關(r=0.98，P<0.01)，其中在33.3mmol/L葡萄糖濃度培養HCM細胞中的表達最高(P<0.01，圖1)。

圖1 高糖培養心肌細胞中RP11-1C8.5的表達

2.RP11-1C8.5干擾腺病毒對HCM細胞中RP11-1C8.5表達的影響:RP11-1C8.5干擾腺病毒和對照腺病毒感染HCM細胞后，倒置熒光顯微鏡可見綠色熒光蛋白，提示腺病毒感染HCM細胞充分。對照組和實驗組HCM細胞中RP11-1C8.5表達分別為8.68±1.47和1.04±0.58，RP11-1C8.5在實驗組HCM細胞中表達含量顯著降低(P<0.01，圖2)。

圖2 RP11-1C8.5干擾腺病毒和對照腺病毒感染HCM細胞的效率(×40)

3.敲減RP11-1C8.5對HCM細胞凋亡的影響:流式細胞術顯示，RP11-1C8.5干擾腺病毒和對照腺病毒感染HCM細胞后，實驗組和對照組HCM細胞凋亡率分別為7.85%±2.67%和16.33%±2.82%，與對照組比較，敲減RP11-1C8.5明顯抑制HCM細胞的凋亡(P<0.01，圖3)。

圖3 流式細胞術檢測敲減RP11-1C8.5對HCM細胞凋亡的影響

4.敲減RP11-1C8.5對HCM細胞活力的影響:CCK-8法結果顯示，從2天起，實驗組HCM細胞活力明顯高于對照組，敲減RP11-1C8.5明顯促進HCM細胞的活力(P<0.05，圖4)。

圖4 CCK-8檢測敲減RP11-1C8.5對HCM細胞活力的影響

5.RP11-1C8.5與miR-181a-5p相互作用的鑒定:通過生物信息學starBase v2.0軟件預測(圖5)，RP11-1C8.5序列的4546-4562區域與miR-181a-5p存在結合位點，結合評分為0.992。雙熒光素酶報告基因實驗顯示，共轉染RP11-1C8.5-wt與miR-181a-5p mimic的相對熒光素酶活性相對于NC mimic顯著降低(P<0.01)，將結合位點突變后，兩組相對熒光素酶活性比較差異無統計學意義(P>0.05，圖6)。

圖5 生物信息學預測RP11-1C8.5的作用機制

圖6 雙熒光素酶報告基因鑒定RP11-1C8.5與miR-181a-5p的相互作用

6.敲減RP11-1C8.5對miR-181a-5p表達的影響: qPCR結果顯示，實驗組和對照組HCM細胞miR-181a-5p的表達分別為0.30±0.15和1.02±0.22，敲減RP11-1C8.5可顯著促進miR-181a-5p的表達(P<0.01)。

7.敲減RP11-1C8.5對凋亡相關蛋白表達的影響: Western blot法檢測結果顯示，與對照組比較，實驗組HCM細胞促凋亡蛋白Bax、caspase3表達降低，抗凋亡蛋白Bcl-2、CED-9表達增加(圖7)。

圖7 Western blot法檢測相關凋亡蛋白表達情況

討 論

lncRNA是由外顯子或內含子通過剪切形成的非編碼RNA，廣泛存在于真核細胞[11]。lncRNA通過調控基因的可變剪切和轉錄過程，參與細胞的各種生物學過程[12]。研究顯示，lncRNA廣泛影響心血管疾病如心肌纖維化、心室肥厚、心肌炎的進程[13～15]。lncRNA在糖尿病心肌病中的作用備受關注。Ni等[16]研究發現，下調lncRNA ZFAS1能夠抑制心肌細胞的凋亡和鐵死亡，減緩糖尿病心肌病的進展，miR-150-5p是lncRNA ZFAS1的靶基因。Xiao等[17]研究發現，lncRNA MIAT在糖尿病患者血清以及高糖誘導的心肌細胞中的表達均升高，沉默lncRNA MIAT后心肌細胞焦亡相關因子IL-1、IL-18表達水平下調，lncRNA MIAT通過調控心肌細胞焦亡參與糖尿病心肌病的進展。RP11-1C8.5是近年來新發現的lncRNA，其在心肌細胞中的作用未見報道。

本研究顯示，與正常葡萄糖濃度比較，經過高糖培養后的心肌HCM細胞中RP11-1C8.5表達顯著上調，且其表達水平與葡萄糖濃度呈現顯著的相關性，提示RP11-1C8.5可能參與糖尿病心肌病的病理改變。為進一步明確RP11-1C8.5在糖尿病心肌病進展中的作用，本研究采用腺病毒感染技術在HCM細胞中沉默RP11-1C8.5表達。敲減RP11-1C8.5表達后，HCM細胞的凋亡率明顯降低、細胞活力明顯升高，同時促凋亡蛋白Bax、caspase3表達降低，抗凋亡蛋白Bcl-2、CED-9表達增加，提示RP11-1C8.5參與糖尿病心肌病的進展。已有研究證實，lncRNA通過海綿吸附下游微小RNA(miRNA)，通過降低miRNA表達調節細胞的生物學行為[18～20]。本研究通過生物信息學預測與雙熒光素酶報告基因實驗，證實了RP11-1C8.5與miR-181a-5p的結合作用。Zhao等[21]研究發現，miR-181a-5p在高糖處理的心肌細胞中表達下調，miR-181a-5p可顯著抑制炎性細胞因子的表達，促進心肌細胞活力，抑制心肌細胞炎癥和凋亡。本研究進一步證實，在高糖培養的HCM細胞中敲減RP11-1C8.5可顯著升高miR-181a-5p的表達水平，表明RP11-1C8.5通過結合miR-181a-5p在糖尿病心肌病中發揮作用。

綜上所述，RP11-1C8.5在高糖培養的心肌細胞中表達上調，敲減RP11-1C8.5可通過上調miR-181a-5p表達，抑制心肌細胞的凋亡并促進心肌細胞的活力。敲減RP11-1C8.5可能是阻斷糖尿病心肌病發展的有效策略。