呼出氣揮發性有機物檢測應用于診斷肺部感染的研究進展

陳釗銘，李征途，葉 楓

人類利用呼出氣診斷疾病具有十分悠久的歷史，古希臘的希波克拉底（公元前460—370 年）首次描述了傷寒與呼出氣的關系。18 世紀末，安托萬·拉瓦錫發明了現代呼氣檢測方法，從而發現了氧氣和二氧化碳，取代了燃素理論[1]。20 世紀80 年代13C-尿素呼氣試驗首次用于幽門螺桿菌感染的診斷。經過30 年的發展，尿素呼氣試驗已被認為是診斷幽門螺桿菌感染的金標準[2]。2011 年，美國胸科協會制定了呼出氣一氧化氮（fractional exhaled nitric oxide，FeNO）測定作為一種無創方法來診斷哮喘和監測抗炎治療療效的應用指南，并強烈建議使用FeNO測定診斷嗜酸性氣道炎癥[3]。呼出氣揮發性有機物（VOC）檢測作為一種新型生物標志物分析方法，促進了呼出氣代謝組學在臨床中的應用與發展[4]。

1 呼出氣VOC 檢測應用于肺部感染診斷的原理和方法

人體VOC 的產生與自身新陳代謝有著密切聯系，機體在患病狀態下，某些代謝通路增強或減弱可導致細胞及周圍環境的pH 值發生改變，為了維持內環境平衡，機體會產生相應的化學物質，即VOC 進行中和[5]。血液中的VOC 能通過氣體交換經血氣屏障到達肺泡，因此肺泡VOC 的濃度可代表血液中的濃度[6]。有學者推測，肺部感染性疾病患者產生的VOC 可能來自3 個方面：宿主生理代謝過程的產物、微生物病原體代謝過程的產物以及宿主抵抗病原體產生免疫應答過程的產物[7]。

呼出氣VOC 檢測技術依賴于近年來質譜技術的不斷發展，主要檢測方法可分為直接分析檢測和離線分析檢測。直接分析法所用質譜技術包括質子轉移質譜、選擇性離子流動管質譜、離子遷移譜、激光光譜技術、電子鼻技術等。直接分析法可連續監測VOC 的動態變化，不需要預先濃縮或儲存呼吸樣品，且成本較低。其局限性在于檢測范圍有限，不支持絕對識別，例如雖然離子遷移譜可根據呼出氣成分在電場的行為來識別其成分，電子鼻技術可通過各種排列分布傳感器識別信號的改變來區分患者與健康人，但均不能識別單個化合物；選擇性離子流動質譜同樣不能辨別同分異構體。

離線分析法中氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）是呼出氣VOC 檢測的“金標準”，其不僅可以分離出呼出氣VOC，還可精確進行辨別和定量，但該機器體積龐大且價格高昂，難以實現床旁快速檢測。此外，間接分析方法還需要解決樣品采集問題，如需對全部氣體成分進行分析，可使用Tedlar 氣袋或金屬罐進行采樣。Tedlar 氣袋可重復利用，不易泄露，但僅可保存數小時；金屬容器密閉性更好，保存時間長，但成本過高且難以清洗。如只需對部分類別的化合物進行靶向分析，通常采用預濃縮的方法進行檢測，如熱解析法、固相微萃取、分子過濾篩等方法，這些方法亦存在碎片化、靈敏度不高、難以定量等問題[5，8-9]。

2 各種病原體呼出氣VOC 檢測的研究進展

2.1 細菌

基礎研究方面，Bean 等[10]采用二次電噴霧電離質譜技術通過細胞實驗和動物實驗對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等產生的特異性VOC 進行研究，發現病原體自身能產生部分特異性VOC，且這些VOC 與宿主的免疫應答有關。通過體內、體外VOC 二次電噴霧電離質譜技術指紋圖譜比較，發現存在一定的差異性[11-12]。Lawal 等[13]利用人工痰液和營養液培養菌，對其頂空進行采樣后通過熱解析氣相色譜-質譜聯用（TD-GC-MS）分析VOC，識別出此前報道的揮發性標志物吲哚和1-十一烯，并檢測到新發現的化合物環戊酮和1-己醇。研究者進一步研究了培養基成分，以確定培養基對于VOC 產生的影響，結果顯示在不同培養環境下，細菌產生的VOC 存在差異。此外，研究者對A549 Ⅱ型肺泡上皮細胞株分別在有和無銅綠假單胞菌的情況下進行培養，并利用過氧化氫培養A549 細胞，誘導氧化應激反應，研究上皮細胞損傷產生的標志物，發現銅綠假單胞菌產生的VOC 標志物主要為乙醚基化合物[14]。

臨床研究方面，研究者利用GC-MS 檢測肺部感染患者呼出氣VOC，發現呼出氣VOC 能有效區分肺部感染患者與非感染者。Filipiak 等[15-17]進行的一項開放性隨機臨床試驗，招募了28 例患嚴重顱內疾病的機械通氣患者，發現感染金黃色葡萄球菌或白念珠菌患者的呼出氣VOC 與前期體外研究中相應病原體釋放的代謝物重疊，其濃度分布與感染過程相關。Neerincx 等[18]亦發現呼出氣VOC 譜可區分感染與非感染肺囊性纖維化患者，并確定了9 種有鑒別意義的重要化合物。有學者對感染鮑曼不動桿菌的呼吸機相關性肺炎患者的呼出氣樣本進行分析，結果表明通過VOC 譜可以區分患者下呼吸道鮑曼不動桿菌的存在與否，及鮑曼不動桿菌的感染與定植[19]。這些研究顯示，將代謝生物標志物從細胞體外研究和動物模型體內研究轉移到人體研究是可行的，但在臨床使用之前需要進一步完善和驗證。

2.2 病毒

病毒VOC 檢測目前仍限于細胞和動物實驗。一些學者通過GC-MS 檢測甲型流感病毒、乙型流感病毒、腺病毒[20-21]、呼吸道合胞病毒等感染細胞后產生的VOC，發現這些細胞產生的VOC 中，以酯和其他含氧化合物為主，可能與感染引起的炎性反應及氧化應激增加相關。

Schivo 等[22]將感染鼻病毒的人支氣管原代上皮細胞、熱滅活的鼻病毒和Toll 樣受體（TLR）激動劑poly（I：C）處理的細胞與對照組進行比較，結果顯示受感染細胞中脂族醇、支鏈烴和二甲基硫化物等化合物存在差異表達，這些化合物可能與氧化應激有關。但單純的TLR3 激動劑無法激活細胞產生相應物質，提示這些標志物的產生與病毒復制相關。

Traxler 等[23]通過GC-MS 對甲型流感病毒感染豬分別在感染前、感染期、康復后對其呼出氣VOC 進行分析，發現乙醛、丙醛、乙酸正丙酯、甲基丙烯酸甲酯、苯乙烯和1，1-二丙基丙烷等6種VOC 可能與疾病進展有關。在接種病毒后的第4 天，感染組檢測到甲型流感病毒陽性時，對照組與感染組的呼出氣VOC 呈現差異。

2.3 曲霉

2-戊基呋喃被認為是曲霉感染患者呼出氣VOC 中極為重要的標志物。研究發現，曲霉在血瓊脂、營養瓊脂和其他培養基上培養可產生2-戊基呋喃[24]。在隨后的一項前瞻性觀察研究中，通過GC-MS 檢測有侵襲、定植曲霉風險的慢性肺部疾病患者及健康人呼吸樣本中的2-戊基呋喃，結果發現2-戊基呋喃呼氣試驗的靈敏度和特異度為77%和78%[25]。有報道顯示2 例嚴重免疫抑制的侵襲性肺曲霉病患者，在其多個呼出氣樣本中檢測到2-戊基呋喃，但經過有效治療后未再檢測到2-戊基呋喃[26]。此外，萜類化合物亦受到人們關注，Koo 等[27]通過TD-GC-MS 對曲霉進行體內、體外呼氣試驗，發現單萜類化合物α-和β-蒎烯、檸檬烯，倍半萜化合物α-和β-反式香檸檬烯是煙曲霉獨特的揮發性代謝產物。Gerritsen 等[28]對曲霉臨床分離株和標準株進行培養，進一步利用GC-MS 對其培養基樣品進行分析，同時對患者呼出氣VOC 進行檢測，并將二者的結果進行比較，由曲霉感染可產生1，3-戊二烯、2-甲基-1-丙醇和2-甲基異莰醇等代謝產物。值得注意的是，上述研究中的呼出氣樣本和培養物中均未檢測到2-戊基呋喃，有學者認為2-戊基呋喃可能來源于血紅蛋白，由培養基中的血瓊脂或者患者肺出血產生，而不是來自真菌本身。生長培養基或分離物的不同亦將導致檢測到的VOC 存在差異，例如只有在培養基中添加彈性蛋白時才能檢測到倍半萜類化合物。事實證明真菌產生VOC 是一個動態的過程[29]，因此需要在不同時間點采用多種 VOC 組合的方式進行檢測，才能更好地將體外實驗結果應用于臨床試驗。

3 呼出氣VOC 應用于肺部感染病原體檢測的前景

傳統的病原體檢測方法如培養、血清學和分子檢測等常需耗費數小時到數天，甚至需要復雜、有創的采樣技術，如支氣管肺泡灌洗。因此，呼出氣VOC 的檢測作為一種無創、快速、靈敏的檢測方法，具有一定的應用前景。但仍然存在以下問題需要解決：①背景空氣及其個體差異對呼吸成分的影響，這需要更加嚴格地做好參照及采樣的質量控制；②現階段研究仍缺乏統一標準，不同設備之間一致性及真實性尚需考證；③體內外研究結果的明顯差異也提示仍需要對呼出氣VOC的產生來源作一步探索。未來呼出氣VOC 可作為識別肺部感染病原體的標志物應用于臨床，但需要更多的動物實驗及臨床試驗數據進行驗證。