鮑曼不動桿菌群體感應抑制劑與生物膜形成的研究進展

成婷婷，馮 媛，王崇剛

鮑曼不動桿菌是一種非乳糖發酵、專性需氧的革蘭陰性桿菌，是醫院常見的條件致病菌之一。鮑曼不動桿菌耐藥機制復雜，且多種耐藥機制并存，造成較高的耐藥率，生物膜形成是鮑曼不動桿菌耐藥的重要機制之一。生物膜是細菌依附于各種生物與非生物表面由自身產生胞外多糖、基質蛋白和胞外 DNA 等大分子物質的一種高度結構化的膜狀復合物。群體感應系統（QS）在鮑曼不動桿菌中參與生物膜形成，還通過調控耐藥基因表達來影響生物膜的耐藥。因此，干擾QS 信號或可成為人類對抗細菌感染和攻克耐藥問題的新靶點[1]。本文主要介紹鮑曼不動桿菌生物膜形成過程、耐藥原因及群體感應的最新進展，為群體感應抑制劑（QSI）的研發提供新思路。

1 生物膜形成過程

生物膜形成過程包括細菌黏附、形成微菌落、早期結構形成、成熟生物膜形成、生物膜內細胞的釋放等過程[2]。整個形成過程受到許多因素調控：①CsuA/BABCDE 伴侶蛋白分泌系統和BfmRS 調控系統分別產生和調節菌毛形成和介導初始黏附；②表面黏附蛋白 Bap 參與生物膜起始黏附，促進生物膜成熟；③OmpA 參與生物表面生物膜形成，介導鮑曼不動桿菌對人上皮細胞的黏附；④O-連接蛋白糖基化系統能提高細菌生物膜形成能力，促進細菌的初始附著并增強成熟生物膜的質量和密度；⑤QS 通過感應細胞密度產生QS 信號分子，進而影響細胞群密度和生物膜形成[3]。

2 群體感應在生物膜形成中的調控作用

2.1 群體感應

QS 是細菌自身群體密度信號感應系統，是細菌自身分泌自誘導信號分子相互溝通的過程。細菌細胞間相互交流，產生小的、可擴散的、類似激素的分子，產生信號分子N 酰基高絲氨酸內酯（AHL，自誘導劑分子），可用于監測種群密度[4]。信號分子感受細菌群體密度，調控相應基因表達，改變細菌生存方式，自誘導劑特異性地與轉錄調節因子結合，進而調控毒力因子、生物膜形成和代謝產物的產生等過程。QS 通過有效的細胞間通訊，使種群在一個更好的環境中生存和繁殖[5]。

2.2 群體感應分子

在費氏弧菌中發現了第一個自誘導劑及其同源調控系統，該系統由兩個LuxI 和LuxR 蛋白家族的蛋白組成。由LuxI 合成的自誘導劑直接與LuxR 蛋白相互作用，該復合物結合到luxe-box 啟動子的特定順式作用序列上，從而調控QS 靶基因的表達。由于LuxI 的表達也被AHL 結合的LuxR激活，一旦QS 被激活，就會誘導產生自誘導劑，使周圍環境充滿信號分子。這種正反饋回路是QS的標志[6]。費氏弧菌的LuxI/LuxR 調控系統被認為是革蘭陰性菌QS 基因的調控模式。鮑曼不動桿菌的QS 機制由一個與革蘭陰性菌中典型的LuxI/LuxR 系統同源的雙組分系統AbaI/AbaR 介導[7]。鮑曼不動桿菌QS 主要由AbaI（信號分子合成酶）、AbaR（轉錄調節蛋白）以及 AHL 3 個組分構成。信號分子合成酶AbaI 是催化合成群體感應信號分子AHL 的胞內酶，催化酰基載體蛋白上的酰基側鏈與 S-腺苷甲硫氨酸的高絲氨酸基團結合，合成酰基化的AHL。AbaR 是群體感應信號分子 AHL的受體，同時也是群體感應的轉錄調節蛋白。當環境中AHL 水平低于閾值水平時，信號無法被檢測，此時細菌不斷生長繁殖從而使AHL 不斷積累，直到環境中的 AHL 濃度達到能被檢測的閾值水平，此時細胞內的 AHL 轉運到其受體蛋白（AbaR）并與之結合，激活了AbaR 的轉錄調節功能，引起相關基因表達的全局性變化[8]。

2.3 群體感應與生物膜形成

鮑曼不動桿菌分泌自誘導分子AHL 進行信息交流，引起聚集，促進鮑曼不動桿菌從浮游狀態向生物膜轉化，主要作用于生物膜形成的中、后期[9]。已發現6 種以上AHL，以含C10 或C12 酰基的AHL 最常見，63%不動桿菌屬細菌至少分泌1 種AHL[10]。AbaI是細菌群體密度調控基因，AbaI失活，生物膜形成減少30%～40%。QS 在耐藥中起重要作用的途徑還包括上調生物膜相關的胞外基質（EPS）和外排泵基因，外排泵AdeFGH可增加生物膜中AHL 分子的轉運[11]。當AHL 分子水平達到閾值，細菌QS 被激活，細菌不斷分泌大量EPS，從而形成生物膜，可阻礙抗菌藥物的滲透作用，產生耐藥性；呈高密度狀態的細菌在感應系統的調控下毒力陡升，同時抑制宿主的免疫系統[12-13]。大量研究表明，鮑曼不動桿菌群體感應與其運動性、抗生素抗性、生存特性和生物膜形成有關[14]。抑制 QS 能夠抑制細菌生物膜形成[15]，增加抗菌藥物敏感性[16]等。

3 抑制群體感應的有效途徑

QS 信號機制的破壞稱為群體猝滅，基于細菌QS 的調控原理，產生了QSI。QSI 通過如下機制發揮作用：①通過干擾合酶抑制信號分子的合成；②破壞細菌信號分子及預防信號分子積累；③阻斷相互作用受體；④作用于AHL 本身的群體猝滅策略。當前已有研究應用 QSI 降低細菌毒力，在費氏弧菌、哈氏弧菌、霍亂弧菌、銅綠假單胞菌和大腸埃希菌等致命病原體中，已有報道應用 QSI抑制細菌的QS，抑制細菌毒力因子，但不干擾細菌生長，從而控制這些病原微生物的感染。針對鮑曼不動桿菌已經提出了許多群體猝滅策略。近年來，提出了許多天然或合成的QSI。這些抑制劑是QS 的小分子調節劑，這些調節劑可以是AHL類似物（非天然AHL）、受體抑制劑或來自天然產物或合成分子的合酶抑制劑等[17]。以下將分別闡述4 種群體感應抑制途徑。

3.1 針對AHL 合酶

AHL 合酶負責合成信號分子AHL。鮑曼不動桿菌中產生AHL 的酶是AbaI 合成酶，AHL 與細胞表面受體分子結合，啟動QS 過程。以AHL 合酶為靶點是一種有效的群體猝滅策略。當合成酶被抑制時，信號分子不能合成，QS 機制停止。此外，這也可能干擾細胞的毒性機制[18]。

3.2 針對AHL 信號分子

AHL 信號分子是由LuxI 家族將脂肪酸酰基衍生物轉移到sadenoyl-methionine（SAM）的氨基上形成的。鑒于此反應的性質和所涉及的前體，可以使用SAM 或脂肪酸生物合成抑制劑作為AHL 的QSI，如sadenosyl-同型半胱氨酸（SAH）、sinefungin、5-甲基硫腺苷、各種SAM 類似物和SAM 生物合成抑制劑環亮氨酸均可抑制AHL 的產生。阿奇霉素干擾銅綠假單胞菌中C4-高絲氨酸內酯（C4-HSL）和3-oxo-C12-HSL 的合成，從而減少細菌對聚苯乙烯表面的黏附。此外，在慢性肺部銅綠假單胞菌感染的小鼠模型中，阿奇霉素治療可顯著改善生物膜的清除[19-20]。在鮑曼不動桿菌中，最常見的是C10 或C12 酰基鏈的長鏈AHL，最近發現了一種群體猝滅酶MomL，Zhang等[21]證實該酶能有效降解各種革蘭陰性菌的不同AHL 信號分子。MomL 是AHL 內酯酶，通過內酯水解催化AHL 降解，MomL 在降低鮑曼不動桿菌LMG10531 生物膜形成的同時，還能增加鮑曼不動桿菌對不同抗生素的敏感性。

3.3 針對靶向受體

研究證實了不飽和脂肪酸棕櫚烯酸（PoA）和霉烯酸（MoA）作為生物膜化合物對鮑曼不動桿菌QS 的影響，這些不飽和脂肪酸在亞抑菌濃度（0.01、0.02 和0.05 mg/L）可以抑制鮑曼不動桿菌ATCC 17978 的運動和生物膜的形成[22]。結果表明，PoA 比MoA 具有更好的抗生物膜作用。這些脂肪酸降低了調節因子AbaR 的表達，減少了AHL 合成，通過降低調節基因表達或通過調節AbaR 活性調節靶向受體，最終都會導致AHL 的低效結合，從而抑制QS[23]，而且外源AHL 的加入可以扭轉這一效應[21]。

3.4 天然產物或合成分子的合酶抑制劑

目前已知植物提取物如乙酸乙酯等具有明顯的抑制QS 活性作用，但尚未完全闡明植物化學物質的確切作用方式[24]。許多天然和合成化合物已被發現可抑制QS[25]，與AHL 結構類似的呋喃酮C-30 可與QS 受體結合，呋喃酮C-30 作為QSI，能夠抑制鮑曼不動桿菌ATCC 19606 菌毛編碼和調節基因表達以及菌毛和生物膜的形成。呋喃酮C-30不影響細菌存活，抗生素與呋喃酮C-30 可以發揮協同作用，雖然已有多項研究表明呋喃酮對生物膜具有QS 抑制作用，但在臨床治療中這些化合物的毒性可能限制其使用[26-27]。

此外，有研究證實QS 信號主要是一些可擴散的小信號分子，包括醇脫氫酶家族（ADH）[28]。針對ADH 抑制劑雙硫素和激活劑牛磺酸的研究進一步證明，ADH 在鮑曼不動桿菌的生物膜生長行為中起著重要的調控作用，雙硫脲抑制ADH 活性和牛磺酸增強ADH 活性可分別降低和增加鮑曼不動桿菌生物膜的形成、生長和運動。由此可見，ADH 在鮑曼不動桿菌的生物膜生長行為中起著重要的調控作用。針對ADH 進行更深入的探索有助于為制定鮑曼不動桿菌感染的治療方案提供新思路。

4 QSI 的優點與不確定性

QSI 通過抑制細菌QS 抑制毒力因子和生物膜的形成，較傳統抗生素具有以下優點：①QSI 不妨礙細菌生長和必需蛋白質合成，研究證實AbaI缺乏不會影響細菌存活，但能降低EPS 含量、抑制毒素產生，不利于成熟生物膜的形成，同時避免殺死有益菌；②QSI 作用緩慢，可避免細菌死亡后釋放大量脂多糖引起敗血癥；③QSI 與抗生素聯合具有協同作用，QSI 可以增強致病菌對抗生素的敏感性，減少抗生素的使用劑量，防止誘導產生耐藥菌，尤其適合治療耐藥革蘭陰性菌引發的感染[1]。因此，干擾QS 被認為是一種很有前景的對抗細菌感染的策略，通過抑制細菌毒力，從而影響病原體致病的能力，而不是影響其生長，不施加選擇壓力，有助于避免耐藥性出現[29]。QSI較傳統抗生素具有以下不確定性：①不確定哪些參數會影響QSI 的發生和基因表達的后續模式；②不確定QS 的誘導會影響生物膜群落的致病潛力，還是改變生物膜的抗菌耐受性，不確定QSI在生物膜群落中的功能后果。

5 結語與展望

生物膜相關感染難清除，也更容易引起復發。找到有針對性的控制和治療措施，是實際抗感染工作急需解決的問題。QSI 可能成為優良的輔助藥物，如果在治療中較早使用，則會延遲甚至消除耐藥性。這將有助于設計輔助藥物療法，如將抗生素和其他具有QSI 效應的物質聯用可以發揮協同作用，以減少藥物的劑量和不良反應、延緩細菌耐藥速度。需要進一步研究QSI 在生物膜形成、維持和擴散中的作用，并在實際應用前開發出無毒、活性更強的QSI。QSI 已被證明是一種很有前景的抗菌膜制劑，在未來治療細菌感染方面有很大的價值。