高效液相色譜法測定鹿胎丹參白芍顆粒中葛根素、芍藥苷及丹酚酸B含量

朱映黎 劉 磊 張建軍 呂美豫 張文雅 侯新娟 王衛茜 王金鳳 谷洪順 王林元

(1 北京中醫藥大學，北京，100029； 2 神威藥業集團有限公司，石家莊，051430； 3 北京采瑞醫藥科技研究院，北京，100094)

鹿胎丹參白芍顆粒由馬鹿胎凍干粉、丹參、白芍、葛根、大豆異黃酮5種成分組成，具有滋補腎精、活血化瘀、祛黃褐斑的功效。方中馬鹿胎補益精血，溫助陽[1]；白芍補益營血，二者同用能夠增強補益精血，潤膚養顏之功；丹參既能活血調經，又能化瘀消斑；葛根升發清陽，輸布精血，又能通經活絡祛瘀[2]；大豆異黃酮調節內分泌，抗氧化，消斑養顏[3]。諸品合用，可達補腎益精，活血通經，化瘀消斑，養顏美容之效。動物及人體研究表明祛黃褐斑作用明確，已上市應用10余年(國食健注G20100485)。但目前對于鹿胎丹參白芍顆粒的質量標準僅停留在大豆異黃酮含量和馬鹿胎凍干粉的氮含量的控制上，不能全面反映其發揮全部功效的內在物質質量。因此，非常有必要進一步提高和完善已上市產品鹿胎丹參白芍顆粒的質量標準，為更好地控制鹿胎丹參白芍顆粒質量、深入研究其祛黃褐斑功能機制內涵提供物質依據。

本研究擬在現行質量標準的基礎上，增加葛根素、芍藥苷及丹酚酸B作為質量控制成分，運用高效液相色譜法同時測定其含量并進行方法學考察，以提高該產品的可控性，完善其檢驗標準，為鹿胎丹參白芍顆粒的綜合評價提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀(沃特世，美國，型號：Waterse2695)；超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司，型號：KQ5200E)；電子天平[賽多利斯科學儀器(北京)有限公司，型號：SQP]。

1.2 試劑 乙腈(上海星可高純溶劑有限公司，批號：0114220309)；甲醇(上海星可高純溶劑有限公司，批號：0212220401)；磷酸(上海星可高純溶劑有限公司，批號：RH297703)。

1.3 分析樣品 葛根素對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：S02M9B54875，純度≥98%)，芍藥苷對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：M28GB143089，純度≥98%)，丹酚酸B對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：P20J10F93457，純度≥98%)；鹿胎丹參白芍顆粒(批號：20211201，20211202，20201203)；陰性樣品(不含葛根、白芍和丹參，實驗室按處方自制)；中藥材(亳州市京皖中藥飲片廠)，本實驗所用葛根、白芍、丹參均來源于實驗3批中試產品的生產原料，經北京中醫藥大學中醫學院李偉高級實驗師確定3種藥材分別來源于豆科植物野葛[Puerarialobata(Willd.)Ohwi]的干燥根，毛茛科植物芍藥(PaeonialactifloraPall.)的干燥根，唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBge.)的干燥根和根莖[2-4]；馬鹿胎凍干粉(長春市慧源鹿業有限公司，批號：20210910T06)；大豆異黃酮(西安天一生物技術有限公司，批號：210802)；糊精(嘉康源有限公司，批號：211010)；羧甲基纖維素鈉(嘉康源有限公司，批號：21040659)；D-甘露糖醇(嘉康源有限公司，批號：112104015)。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱為Waters XBridge C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相A：乙腈(CH3CN)；流動相B：甲醇(CH3OH)；流動相C：0.05%磷酸(H3PO4)水溶液；采用梯度洗脫；流速1.0 mL/min，檢測波長230 nm，柱溫25 ℃，進樣量：10 μL。三元梯度洗脫程序：A相：0～18 min，1%～8%；18～30 min，8%～23%；30～45 min，23%；B相：0～45 min，15%；C相：0～18 min，84%～77%；18～30 min，77%～62%；30～45 min，62%。見表1。

表1 梯度洗脫程序(%)

2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取葛根素、丹酚酸B、芍藥苷對照品適量，加50%甲醇制成每1 mL含葛根素0.250 mg、芍藥苷0.130 mg、丹酚酸B 0.200 mg的混合對照品溶液，搖勻，得混合對照品母液。精密量取10 mL，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取約1.000 g產品，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加入50%甲醇適量，超聲處理30 min，放冷，加50%甲醇定容，精密量取上清液3 mL置10 mL容量瓶中，加50%甲醇定容，即得。按照原樣品配方比例及工藝，分別不含丹參、白芍、葛根制備3種陰性對照品。按照2.2.2項下的方法制備陰性對照品溶液。

2.4 專屬性實驗 取混合對照品、供試品及陰性樣品溶液各10 μL，按“2.1”設定色譜條件進樣測定。供試品中葛根素出峰時間為20.909 min，芍藥苷出峰時間為25.224 min，丹酚酸B的出峰時間為37.616 min，結果陰性樣品在與供試品中葛根素、芍藥苷和丹酚酸B相同的保留時間處無干擾峰。見圖1。

圖1 專屬性高效液相色譜圖

2.5 線性關系考察 精密吸取混合對照品溶液0.5、2、4、8、16、30 μL分別注入高效液相色譜儀中，按照上述“2.1”項下色譜條件進樣分析，測定峰面積。結果以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程和線性范圍。見表2。

表2 直線回歸方程結果

2.6 精密度實驗 分別精密吸取混合對照品溶液10 μL，在上述“2.1”項色譜條件下重復進樣6次，計算丹酚酸B、葛根素和芍藥苷的峰面積，RSD值分別為：0.12%、0.53%和0.56%。

2.7 供試品溶液穩定性實驗 精密吸取同一鹿胎丹參白芍顆粒供試品溶液，分別于0、2、6、12、18、24 h進樣，計算丹酚酸B、葛根素和芍藥苷的峰面積RSD值分別為：2.34%，0.57%和0.96%。

2.8 重復性實驗 取同一批鹿胎丹參白芍顆粒約1.000 g，平行6份，精密稱定，按上述“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別進樣測定并計算相對標準偏差(Relative Standard Deviation，RSD)值。見表3。

表3 重復性實驗結果

2.9 回收率實驗 取同一批鹿胎丹參白芍顆粒約0.600 g，精密稱定，分別按照0.8∶1、1∶1和1∶1.2的比例加入對照品適量，每個比例平行3份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣分析，計算葛根素、芍藥苷、丹酚酸B的平均加樣回收率。見表4～6。

表4 葛根素加樣回收率實驗結果

2.10 樣品測定結果 按照“2.2.2”項下方法制備鹿胎丹參白芍顆粒溶液，按“2.1”項下色譜條件分別測定3批樣品中丹酚酸B、葛根素、芍藥苷的含量，每批樣品平行測定3次，并計算RSD值。見表7。

表5 芍藥苷加樣回收率實驗結果

表6 丹酚酸B加樣回收率實驗結果

表7 鹿胎丹參白芍顆粒中丹酚酸B、葛根素、芍藥苷含量測定結果(mg/g)

3 討論

鹿胎丹參白芍顆粒方中各類成分相互協調、相互促進從而達到祛黃褐斑的效果。結合中藥有效性-物質基礎-質量控制標志性成分評價體系，采用多指標成分質量控制模式，完善鹿胎丹參白芍顆粒的質量控制，既有助于生產企業和食品藥品監管部門不斷提高該產品的質量控制標準，也可逐步完善鹿胎丹參白芍顆粒原藥材的質量控制標準，從源頭上確保鹿胎丹參白芍顆粒產品質量和臨床療效的穩定性。但目前對于鹿胎丹參白芍顆粒的質量標準僅停留在大豆異黃酮中各成分的含量測定以及馬鹿胎凍干粉中氮含量的測定，不能全面反映其發揮全部功效的內在物質質量。

丹酚酸B、芍藥苷和葛根素分別作為丹參、白芍和葛根中的標志性成分。其中丹酚酸B具有很強的抗氧化性，它既可通過抗氧化機制抑制黑色素的生成，也可通過改善微循環加快黑色素的清除[4-5]。芍藥苷可以通過抑制氧化亢進、改善線粒體功能障礙、抑制或活化抗氧化酶相關通路、增強抗氧化能力、調節Keap1/Nrf2信號通路等多通路多靶點的方式改善氧化應激以及緩解黑色素形成[6-8]。葛根素是葛根異黃酮中的一種，能夠清除氧自由基及抗脂質過氧化，通過降低酪氨酸酶的活性抑制黑色素的形成[9-10]。因此，本研究擬在現行質量標準的基礎上，增加葛根素、芍藥苷及丹酚酸B作為質量標準成分，運用HPLC法測定其含量并進行方法學考察。

在2020版《中華人民共和國藥典》中，葛根素的測定流動相為甲醇：水，芍藥苷的測定流動相為乙腈：0.1%磷酸溶液，丹酚酸B的測定流動相為乙腈：0.1%磷酸溶液。陳麗艷[11]采用HPLC同時測定葛根素、芍藥苷和丹酚酸B 3種成分選用流動相為乙腈、甲醇和0.05%磷酸溶液。本實驗結合鹿胎丹參白芍顆粒的配方特點，在此基礎上，參照色譜峰性能、分離效果、保留時間等指標，重新調整甲醇比例為15%，使色譜分離達到最佳效果。在制備供試品溶液時，由于丹酚酸B具有熱不穩定性，因此采用50%甲醇溶液超聲提取進行制備，提取效果最佳[12]。并且，通過對這3種成分分別進行檢測，最終確定測定波長為230 nm處各成分有較大吸收，且最晚出峰時間為35 min，因此設定檢測時間為45 min。鹿胎丹參白芍顆粒中葛根素、芍藥苷及丹酚酸B的相對含量為18.94、10.15、9.25 mg/g；加樣回收率的RSD值分別為1.63、1.01、1.38%(RSD%<2)。表明本研究所建立的同時測定鹿胎丹參白芍顆粒中葛根素、芍藥苷及丹酚酸B含量的新方法準確度高、重復性好、穩定性優，線性結果符合要求，能有效地控制鹿胎丹參白芍顆粒的質量。

目前鹿胎丹參白芍顆粒的產品規格為5 g/袋，服用方法為1袋/次，2次/d，沖飲。根據本研究建立的方法測定含量，每10 g鹿胎丹參白芍顆含有葛根素189.4 mg、芍藥苷101.5 mg、丹酚酸B92.5 mg，提示其活性成分含量高，為后續探討有效成分作用靶點，深入闡釋產品作用機制，進一步開展人體小樣本、大樣本實驗奠定物質基礎。

綜上所述，本研究在鹿胎丹參白芍顆粒現行質量標準的基礎上，增加了葛根素、芍藥苷及丹酚酸B作為含量測定項的指標性成分，建立了可同時測定鹿胎丹參白芍顆粒中葛根素、芍藥苷及丹酚酸B含量的新方法，可為鹿胎丹參白芍顆粒的質量標準提升提供實驗依據。