艾煙和香煙對APP/PS1雙轉基因小鼠海馬β-淀粉樣蛋白及血清炎癥介質的影響

何夢如 王 昊 劉雅潔 黃躍平 吳嘉威 趙百孝

(1 北京中醫藥大學針灸推拿學院，北京，102488； 2 解放軍總醫院第六醫學中心針灸科，北京，100048； 3 北京中醫藥大學東直門醫院，北京，100007)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s Disease，AD)是一種神經系統退行性疾病，以記憶障礙、認知功能障礙以及其他神經精神癥狀和行為障礙為主要臨床表現[1]。AD具有發病率高、危害性大的特點，是全球第7大死亡原因，也是社會經濟成本最高的疾病之一[2-3]。AD的2個核心病理特征是腦內β-淀粉樣蛋白異常沉積形成的老年斑和tau蛋白過度磷酸化引發的神經纖維纏結(Neurofibrillary Tangle，NFT)[4]。有研究認為大腦中持續免疫反應的存在已經成為AD的第3個核心病理特征，除了β-淀粉樣蛋白異常沉積形成的老年斑和NFT外，AD患者的大腦還表現出持續的炎癥反應[5]。神經炎癥與β-淀粉樣蛋白、NFT相互作用，共同參與AD的發病機制，加速AD病變發展[6-7]。

研究表明，空氣顆粒物污染與AD發病正相關[8]。香煙煙霧作為一種常見的空氣污染物，其與AD的關系一直備受爭議[9-12]。而艾煙作為艾灸療法起效過程中的關鍵因素之一，具有抗衰老、抗炎、抗氧化等作用及多種生物活性[13-14]。本課題組前期研究發現一定濃度(5～15 mg/m3)的艾煙可以提高AD模型動物的學習記憶功能，減少β-淀粉樣蛋白沉積，改善腦內氧化應激狀態，從而延緩AD病理進程[15-17]。本實驗通過對比觀察艾煙和香煙2種不同的煙霧干預方式對APP(β-淀粉樣前體蛋白)/PS1(衰老蛋白1)模型小鼠海馬β-淀粉樣蛋白沉積及血清炎癥介質的影響，以期探索艾煙對AD神經炎癥的作用機制，并驗證香煙對AD的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 本實驗選用無特定病原體(Specific Pathogen Free，SPF)級24周齡雄性APP/PS1雙轉基因小鼠作為AD動物模型，采用同齡相同遺傳背景的雄性C57BL/6小鼠作為空白對照，體質量28～32 g。小鼠均購于北京唯尚立拓生物科技有限公司[許可證號：SCXK(京)2016-0009]，所有小鼠均飼養于青島大學醫學部動物實驗中心，均自由進食飲水，并采用常規小鼠飼料喂養。飼養環境溫度為(22±2)℃，環境濕度為(50±5)%，采用半自動電路控制飼養室內照明，保持12 h光照(8:00～20:00)和黑暗(20:00～次日8:00)交替循環。實驗過程均遵循2006年國家科技部頒布的《關于善待實驗動物的指導性意見》。本研究經北京中醫藥大學實驗動物倫理委員會批準(倫理審批號：BUCM-4-2020011401-1010)。

1.1.2 試劑與儀器 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-8(IL-8)、血清淀粉樣蛋白A(SAA)、C反應蛋白(CRP)酶聯免疫吸附測定試劑盒(北京瑞格博科技發展有限公司，批號：20210909.60080M;60024M;60199M;60197M)，無水乙醇(國藥集團化學試劑有限公司，批號：10009257)，二甲苯(國藥集團化學試劑有限公司，批號：10023418)。酶標儀(Thermo Fisher Scientific，美國，型號：Multiskan MK3)，石蠟切片機(LEICA，德國，型號：RM2235)，高速冷凍離心機(Thermo Fisher Scientific，美國，型號：ST16)，光學顯微鏡(Nikon，日本，型號：Eclipse E200)，超低溫冰箱(Thermo Fisher Scientific，美國，型號：Forma902GP-ULTS)，訂制小鼠灸用細艾條(湖北蘄春李時珍醫藥集團，規格φ8 mm×150 mm)，香煙(上海煙草集團北京卷煙廠有限公司，混合型，焦油含量11 mg，尼古丁含量1.1 mg，CO含量12 mg)，玻璃缸(自制，規格80 cm×80 cm×60 cm)，光散射式數字微電腦粉塵儀(北京賓達綠創科技有限公司，型號：P-5L2C)，小鼠固定器(北京健力園有限公司，規格150 mm×65 mm×50 mm)。

1.2 方法

1.2.1 分組 將36只24周齡雄性APP/PS1小鼠按隨機數字表法分為模型組、艾煙組和香煙組，每組12只，12只具有相同遺傳背景的C57BL/6小鼠作為空白組。

1.2.2 干預方法 所有小鼠適應性喂養1周后開始進行干預。將艾煙組小鼠置于小鼠固定器內，然后將固定器放入自制玻璃缸中，玻璃缸內放置已調試好的激光粉塵測試儀。點燃艾條后將艾條放置在玻璃缸角落處，使用USB(通用串行總線)電源驅動小型風扇令艾煙均勻地充滿整個玻璃缸。每隔3 min用粉塵測試儀測試其煙霧濃度，使玻璃缸中的艾煙濃度控制在5～15 mg/m3之間。香煙組使用香煙煙霧進行干預，操作同艾煙組。模型組和空白組每天行抓取固定，不做其他干預。干預20 min/d，6次/周，共計8周。

1.2.3 檢測指標與方法 各組干預結束后1 d，腹腔注射1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)溶液麻醉小鼠，眼球摘除法取血，經心臟灌注后取出腦組織，待切片觀察。嚴格按照說明書標準程序操作，使用剛果紅染色法比較不同組小鼠海馬的β-淀粉樣蛋白沉積變化，采用酶聯免疫吸附試驗法測定血清中TNF-α、IL-8、SAA、CRP含量。剛果紅染色：小鼠海馬組織切片后貼在載玻片上，然后依次放置于乙醇氯化鈉溶液中5 min和剛果紅乙醇氯化鈉溶液中30 min，自來水沖洗。隨即進行乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂膠封固。使用光學顯微鏡進行觀察、拍照，剛果紅染色陽性表現為橘紅色顆粒。酶聯免疫吸附試驗法：使用眼球摘除法取血1.0～2.0 mL，置于離心管中靜置1 h左右，離心15 min(4 ℃，2 500 r/min，離心半徑10 cm)。離心后取上層血清放入凍存管中，-80 ℃冰箱中保存待檢測。按照酶聯免疫吸附試驗試劑盒說明書進行操作，使用酶標儀在450 nm波長下測量各孔的吸光度值(A值)。根據標準品的濃度及對應的A值，以A值為縱坐標，以標準品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據樣品的A值在回歸方程上分別計算出血清TNF-α、IL-8、SAA、CRP的含量。

2 結果

2.1 各組小鼠海馬β-淀粉樣蛋白沉積情況 空白組小鼠海馬未見明顯橘紅色物質沉積，細胞排列整齊；模型組小鼠海馬可見明顯橘紅色β-淀粉樣蛋白沉積(箭頭所指)，呈點斑片狀，大小不一，細胞排列散亂、稀疏；香煙組小鼠見大量橘紅色β-淀粉樣蛋白沉積，細胞排列不整，見較多空隙，細胞凋亡壞死較嚴重；艾煙組小鼠海馬見散在橘紅色β-淀粉樣蛋白沉積，細胞排列整齊，偶見神經元缺失造成的空隙。見圖1。

圖1 各組小鼠海馬β-淀粉樣蛋白沉積情況(剛果紅染色)

2.2 各組小鼠血清TNF-α、IL-8、SAA、CRP表達情況

2.2.1 各組小鼠血清TNF-α含量比較 各組小鼠血清中TNF-α的含量由高到低依次是香煙組>模型組>艾煙組>空白組。與空白組比較，模型組、香煙組小鼠血清TNF-α明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，艾煙組差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組比較，香煙組小鼠血清TNF-α含量有升高趨勢但差異無統計學意義(P>0.05)，艾煙組小鼠血清TNF-α含量有下降趨勢但差異無統計學意義(P>0.05)；與香煙組比較，艾煙組小鼠血清TNF-α含量顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.2.2 各組小鼠血清IL-8含量比較 各組小鼠血清中IL-8的含量由高到低依次是香煙組>模型組>艾煙組>空白組。與空白組比較，模型組、香煙組和艾煙組小鼠血清IL-8均明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，香煙組小鼠血清IL-8含量有升高趨勢但差異無統計學意義(P>0.05)，艾煙組小鼠血清IL-8含量明顯下降(P<0.05)；與香煙組比較，艾煙組小鼠血清IL-8含量顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠血清TNF-α、IL-8含量比較

2.2.3 各組小鼠血清SAA含量比較 各組小鼠血清中SAA的含量由高到低依次是香煙組>艾煙組>模型組>空白組。與空白組比較，香煙組小鼠血清SAA含量顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；其余各組之間比較差異均無統計學意義(均均P>0.05)。見表2。

2.2.4 各組小鼠血清CRP含量比較 各組小鼠血清中CRP的含量由高到低依次是香煙組>模型組>艾煙組>空白組，與空白組比較，模型組、香煙組小鼠血清CRP含量均明顯升高(P<0.05)，艾煙組差異無統計學意義(P>0.05)；與模型組比較，香煙組小鼠血清CRP含量有升高趨勢但差異無統計學意義(P>0.05)，艾煙組小鼠血清CRP含量有下降趨勢但差異無統計學意義(P>0.05)；與香煙組比較，艾煙組小鼠血清CRP含量顯著下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組小鼠血清SAA、CRP含量比較

3 討論

AD的核心病理特征之一是腦內β-淀粉樣蛋白異常沉積，而β-淀粉樣蛋白是由APP裂解而來[18]。在正常情況下，APP的產生和降解處于一種動態平衡。然而，當APP在體內的代謝出現異常時，β-淀粉樣蛋白生成增多而清除率下降，導致β-淀粉樣蛋白在腦內大量沉積，誘發神經毒性[19-20]。因此，抑制β-淀粉樣蛋白聚集和促進其降解是治療AD的關鍵途徑。有研究報道，以調節β-淀粉樣蛋白生成和清除失衡為主要作用的抗β-淀粉樣蛋白藥物未能顯著改善AD患者學習認知功能，且不良反應明顯[21-22]。近年來，有研究發現，艾灸督脈可改善APP/PS1小鼠學習記憶和認知功能，加速β-淀粉樣蛋白1-42清除，進而減少β-淀粉樣蛋白1-42沉積。本課題組前期以載脂蛋白E(Apolipoprotein E，ApoE)-/-小鼠為研究對象，觀察發現艾煙能夠發揮ApoE-/-小鼠的海馬CA3區保護作用，減少β-淀粉樣蛋白沉積進而提高ApoE-/-小鼠學習記憶能力[23-25]。本研究通過剛果紅染色法和電鏡觀察小鼠海馬的組織形態，說明艾煙的確能夠有效減少β-淀粉樣蛋白在APP/PS1小鼠腦內的沉積，香煙則加重β-淀粉樣蛋白的沉積，可能與艾煙的芳香氣味作用于嗅覺傳導通路的神經遞質有關。

神經炎癥是目前比較公認的神經退行性疾病的重要生理病理特征。由β-淀粉樣蛋白級聯機制介導小膠質細胞(Microglia，MG)活化、星形膠質細胞增殖，MG活化后不斷分泌TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥介質和活性氮簇、活性氧簇等氧化因子，促炎與抗炎穩態平衡被打破進而造成腦內持續的炎癥反應，加劇β-淀粉樣蛋白的病理學沉積，造成神經元損傷和大腦記憶認知功能障礙，導致AD發生發展的惡性循環[26-29]。TNF-α是AD最主要的炎癥介質之一，與炎癥反應過程中的神經元毒性、腦細胞凋亡及認知功能減退密切相關[30]。IL-8是多源性的炎癥介質，對中性粒細胞有趨化作用，從而實現對炎癥反應的調節，其水平可作為跟蹤AD進展的有效生物標志物[31]。SAA和CRP是機體急性反應時產生的高度敏感蛋白，主要由肝細胞產生，由炎癥介質IL-6誘導,可調節多種細胞炎癥反應，在AD的神經炎癥中起著至關重要的作用，二者水平具有顯著的相關性，聯合檢測可提高炎癥反應的檢出率[32-35]。近期的一項尸檢研究顯示，與對照組比較，AD合并全身性感染患者腦內TNF-α和IL-8水平顯著升高[36]。除了中樞系統的變化外，在AD患者中還觀察到外周免疫的促炎變化[37]，實驗表明，在APP/PS1小鼠中也觀察到外周和中樞炎癥反應的變化，提示AD外周和中樞的炎癥反應之間存在重要的免疫相關通信[38-39]。因此，檢測血清TNF-α、IL-8、SAA、CRP的表達情況可直接反映AD機體的炎癥反應程度。本實驗結果顯示，模型組小鼠血清TNF-α、IL-8、CRP含量明顯增高，艾煙能顯著降低APP/PS1小鼠血清中TNF-α、IL-8和CRP的含量，香煙的作用則完全相反。本團隊前期對ApoE-/-小鼠的研究發現，艾煙可以降低血清中IL-1、IL-6等炎癥介質的含量，減輕炎癥反應[40]，與本實驗結果相一致。說明艾煙能夠有效抑制炎癥反應，可能通過神經炎癥機制在一定程度上改善AD的病理癥狀。

空氣顆粒物污染已日益成為危害人體健康的高風險因素，研究表明暴露于空氣污染物與AD等神經退行性疾病風險增加有關[41]。流行病學調查顯示，在中國，吸煙是許多省死亡率和傷殘調整壽命年的首要危險因素[42]。吸煙已被多數研究證明對AD具有危害性，香煙煙霧的主要成分包括焦油和尼古丁，有部分學者認為尼古丁能夠抗炎抗氧化進而改善AD患者的學習認知能力[43]。然而，本研究結果顯示香煙會加劇APP/PS1模型小鼠海馬的β-淀粉樣蛋白沉積，促進神經炎癥的發生，表明吸煙可能是影響AD發生發展的危險因素。現代研究通過固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用法對艾煙煙霧進行定性分析，發現艾煙中含有多種復雜成分，其揮發性成分有氨、醇類(乙二醇、戊基丁醇)、脂肪烴、芳香烴、萜類化合物及其氧化物等[44]。有臨床調查顯示艾煙的暴露對針灸師的呼吸健康無明顯影響[45]。從中醫的角度來說，“煙熏火燎為之灸”“無煙不成艾，無火不成灸”。表明在中醫艾灸療法過程中，一定濃度的艾煙具備安全性，并且其作用值得重視。本實驗中艾煙作為一種獨立的干預因素，能夠在一定程度上減少AD小鼠海馬的β-淀粉樣蛋白沉積，抑制炎癥反應，進而延緩AD病情發展。

綜上所述，本研究發現艾煙能夠有效減少APP/PS1模型小鼠海馬β-淀粉樣蛋白沉積，抑制炎癥反應，提示可能與AD神經炎癥發病機制相關。艾煙煙霧成分作用于AD相關的起效機制還需要進一步的研究和探索。