補陽還五湯對急性缺血再灌注損傷大鼠的作用機制研究

王穩平 趙曉娟

(1 渭南市中醫醫院內科，渭南，714000； 2 渭南職業技術學院護理學院，渭南，714000)

腦梗死是臨床上常見的缺血性腦血管疾病，隨著近年來溶栓、介入治療等治療方法的推廣，腦梗死患者能夠早期接受再灌注治療，病情的轉歸得到改善。但是，部分腦梗死患者在經歷腦組織缺血再灌注的過程后神經損傷加劇，表現出較高的致死率和致殘率，需要及早進行干預。中醫認為腦梗死屬于“中風”范疇，氣虛為本、痰瘀互結為標，氣虛血瘀是“中風”發生的主要病機，補氣祛瘀是治療中風的關鍵[1-2]。補陽還五湯由黃芪、川芎、當歸、赤芍、桃仁、地龍等中藥組成，具有補氣祛瘀、行氣活血功效，用于腦梗死的治療能夠減輕神經功能損害、降低血黏度，但關于補陽還五湯治療缺血再灌注損傷尚未見報道[3-4]。為了明確補陽還五湯在大腦缺血再灌注過程中的治療價值，本研究具體分析了補陽還五湯對急性大腦缺血再灌注損傷大鼠的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 30只無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級SD大鼠、10～12周齡、體質量250～300 g，購自上海斯萊克實驗動物公司、生產許可SCXK(滬)2017-0005，飼養溫度22～26 ℃、40%～60%濕度，自由攝食飲水。本實驗經醫院動物福利倫理委員會批準通過(倫理審批號：2019032401)。

1.1.2 藥物 補陽還五湯水溶液由渭南市中醫醫院藥劑科制備。

1.1.3 試劑與儀器 超純RNA提取試劑盒(DNaseⅠ)(北京康為世紀公司，貨號：CW0581S)、SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒(北京康為世紀公司，貨號：CW0741S)、UltraSYBR Mixture試劑(北京康為世紀公司，貨號：CW0957S)，基因引物(上海生工公司，貨號：CW0659S)。

1.2 方法

1.2.1 分組及模型制備 將30只SPF級SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、干預組，每組10只。模型組、干預組按照下列方法建立大腦缺血再灌注損傷模型：腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后擺放仰臥位，做頸正中切口后分離左側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，用動脈夾夾閉頸總動脈及頸內動脈，用縫線結扎頸外動脈，在頸外動脈遠端做一小切口，將預先制作好的栓線由切口插入、直至大腦前動脈，松開頸總動脈及頸內動脈的動脈夾，逐層縫合切口；2 h后拔出栓線、使血流恢復再灌注。假手術組分離頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈，但不進行夾閉及結扎操作。

1.2.2 給藥方法 干預組大鼠在造模前給予補陽還五湯干預，劑量按照人的臨床劑量142.5 g/60 kg計算、為14.84 g/kg，灌胃，2次/d，連續14 d；假手術組和模型組給予生理鹽水灌胃，2次/d，連續14 d。最后1次灌胃結束后禁食過夜，第2天進行造模。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 神經行為學評分 再灌注24 h后，按照下列標準進行神經行為學評分：1)無神經功能缺損的癥狀為0分；2)垂直提起患側肢體時，前肢不能伸展為1分；3)行走時向患側轉圈為2分；4)行走時向患側傾倒為3分；5)意識低、不能自發行走為4分。

1.2.3.2 腦組織含水量測定 完成神經行為學評分測定后處死大鼠，解剖得到缺血再灌注側腦組織，迅速測量重量為濕重；將腦組織在105 ℃高溫烤箱內干燥48 d后稱量重量為干重，腦組織含水量=濕重-干重/濕重×100%。

1.2.3.3 基因表達量的檢測 完成神經行為學評分測定后取缺血再灌注側腦組織，采用超純RNA提取試劑盒(DNaseⅠ)分離組織中的RNA，采用SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒將腦組織提取得到的RNA反轉錄為cDNA；取cDNA 1 μL、UltraSYBR Mixture試劑10 μL、引物1 μL、去離子水8 μL混勻為PCR體系，按照程序95 ℃ 20 s、特異性退火溫度25 s、72 ℃ 30 s重復40個循環，得到循環閾值(Ct)后計算基因的表達水平。見表1。

表1 基因的引物序列及退火溫度

2 結果

2.1 各組大鼠間神經行為學評分比較 進行大腦缺血再灌注造模的模型組及干預組大鼠神經行為學評分均明顯升高；造模前接受補陽還五湯干預14 d的干預組大鼠的神經行為學評分明顯低于模型組，2組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組大鼠間神經行為學評分比較分)

2.2 各組大鼠間腦組織含水量的比較 進行大腦缺血再灌注造模的模型組及干預組大鼠腦組織含水量均明顯升高；造模前接受補陽還五湯干預14 d的干預組大鼠的腦組織含水量明顯低于模型組，2組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠間腦組織含水量的比較

2.3 各組大鼠缺血再灌注病灶內Bax、Bcl-2、胱天蛋白酶-3的mRNA表達水平比較 進行大腦缺血再灌注造模的模型組及干預組大鼠缺血再灌注病灶內Bax、胱天蛋白酶-3的mRNA表達水平均明顯升高，Bcl-2的mRNA表達水平均明顯減少；與模型組比較，造模前接受補陽還五湯干預14 d的干預組大鼠缺血再灌注病灶內Bax、胱天蛋白酶-3的mRNA表達水平均明顯減少，Bcl-2的mRNA表達水平均明顯增多，差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表4。

表4 各組大鼠缺血再灌注病灶內Bax、Bcl-2、胱天蛋白酶-3的mRNA表達水平比較

2.4 各組大鼠缺血再灌注病灶內磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B的mRNA表達水平比較 進行大腦缺血再灌注造模的模型組及干預組大鼠缺血再灌注病灶內磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B的mRNA表達水平均明顯減少；造模前接受補陽還五湯干預14 d的干預組大鼠缺血再灌注病灶內磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B的mRNA表達水平均明顯增多，與模型組比較差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表5。

表5 各組大鼠缺血再灌注病灶內磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B的mRNA表達水平比較

3 討論

腦梗死屬于中醫理論中“中風”的范疇，人事不省伴有口角偏斜、言語謇澀和癱瘓是常見的臨床癥狀。中風的中醫病機復雜且具有多樣性，其中氣虛血瘀是受到廣泛認可的中醫病機[5]。《黃帝內經·素問·生氣通天論》中記載：“陽氣者，精則養神，柔則養筋。”《醫林改錯》中明確指出：“虧損元氣、是其本源”“元氣即虛、血管無氣、必停留而瘀。”陽氣虧虛則血運不暢，進而導致瘀血內停、阻塞腦絡并發生中風[6-7]。腦梗死治療的關鍵是早期再通血管、恢復缺血腦組織的血流灌注，但缺血再灌注過程同樣會引起腦組織損傷，需要積極進行防治。中醫理論中尚缺乏對大腦缺血再灌注的直接描述，但大腦缺血再灌注損傷所涉及的病理環節與大腦缺血缺氧損傷所涉及的病理環節類似，因而二者也具有相似的中醫病機，針對性地進行補氣祛瘀治療具有積極作用。

補陽還五湯是由黃芪、川芎、當歸、赤芍、桃仁、地龍等藥物組成的中藥方劑，黃芪作為君藥，具有補氣固表的功效；川芎、當歸為臣藥，具有活血補氣的功效，與君藥聯用可以提升君藥的功效；赤芍、桃仁、地龍等為佐藥，具有散瘀活血的功效，能夠幫助君藥和臣藥直達經絡，發揮最大效果。諸味藥物聯合使用，能夠起到補氣祛瘀、活血固表、通絡散結的作用[8-9]。《醫學衷中參西錄》中記載：“氣之上升者過少、可使腦部貧血，無以養其腦髓神經。”針對“中風”氣虛血瘀的病機給予補氣祛瘀的藥物能夠進行對癥治療[10-11]。補陽還五湯也被臨床研究證實能夠改善中風患者的神經功能[12-13]。本研究對大腦缺血再灌注模型大鼠給予補陽還五湯治療，結果發現，干預組的神經行為學評分及腦組織含水量均明顯下降，提示補陽還五湯能夠減輕大腦缺血再灌注大鼠的神經損傷。

現代藥理學關于補陽還五湯的研究認為，黃芪、川芎、當歸、赤芍、桃仁、地龍等藥物具有組織保護作用，通過阻斷組織細胞凋亡而減輕組織在病理條件下的損傷[14-15]。缺血再灌注過程中細胞凋亡的過度激活是造成腦組織損害的重要病理因素，本研究對缺血再灌注模型大鼠腦組織中相應基因的分析發現：模型組大鼠腦組織中Bax、胱天蛋白酶-3的表達水平均明顯升高，Bcl-2、磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B的表達水平均明顯減少。Bax和Bcl-2是調控凋亡的一對分子，前者促凋亡，后者抗凋亡，最終作用于胱天蛋白酶-3來直接介導細胞凋亡[16-17]；PI3K/AKT信號通路是上游調節凋亡的信號通路，該通路的激活能夠使Bcl-2激活、Bax失活，進而阻礙胱天蛋白酶-3的活化及細胞凋亡[18-20]。本研究用補陽還五湯干預后發現：干預組大鼠腦組織中Bax、胱天蛋白酶-3的表達水平均明顯減少，Bcl-2、磷脂酰肌醇3激酶、蛋白激酶B的表達水平均明顯增多，提示補陽還五湯能激活缺血再灌注腦組織中PI3K/AKT通路介導的抗凋亡作用。

綜上所述，補陽還五湯能夠減輕模型大鼠的急性大腦缺血再灌注損傷，其作用機制可能與PI3K/AKT信號通路介導的凋亡抑制作用有關。