柴達木大肥菇胞內多糖改善氧化應激作用

胡世成，張奮搏，謝惠春，焦迎春

（青海大學農牧學院，青海 西寧 810000）

如今，快節奏的生活環境使機體極易處于氧化應激狀態，如疲勞、缺氧、過量飲食、作息不規律等均會使機體發生氧化應激反應[1]。當機體處于不利環境時，體內活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）大量產生，其生成速率超過機體自身的清除速率，導致氧化系統和抗氧化系統失衡，大量的ROS進入細胞參與生化反應，從而誘發氧化應激[2]。研究發現在疲勞和缺氧狀態下，機體對氧氣的攝取和消耗增加，引起ROS的大量積累導致細胞膜和線粒體受損，使機體發生代謝紊亂、免疫力下降，甚至會出現器質性病變[3]。因而有越來越多的研究者通過抗氧化劑來緩解氧化應激作用，改善機體健康狀態[4]，同時也在不斷探索具有防護氧化應激損傷作用的天然活性成分。

柴達木大肥菇[Agaricus bitorquis（Quél.）Sacc.]又稱雙層環傘菌，是一種生長于青藏高原柴達木盆地的珍稀野生食用真菌[5]。柴達木大肥菇富含蛋白質、纖維素及氨基酸等多種營養物質，同時含有多糖、酚酸、萜烯等活性成分[6]，其中多糖是其主要的活性成分且含量較高。研究證實食用菌多糖具有多種活性功能，如抗氧化、抗腫瘤、抗炎及調節免疫等[7]。研究發現，柴達木大肥菇的菌絲體多糖、子實體多糖、發酵液多糖均具有抗氧化[8]、抗疲勞[9]、耐缺氧[10]等活性，其中從菌絲體中提取的胞內多糖（intercellular polysaccharides，IPS）功能活性尤為突出，是柴達木大肥菇中極具開發潛力的組分之一。傅里葉紅外光譜和核磁共振光譜[8]的結果表明，胞內多糖分子量約為120 kDa，主要由甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸組成，主鏈主要由D-葡聚糖構成，支鏈由α-1，6糖苷鍵連接。然而，對IPS抗氧化應激活性研究鮮見報道。綜上，本研究推測柴達木大肥菇多糖的抗氧化應激作用可能與其調節機體應激代謝和較強的抗氧化水平有關。

本研究以柴達木大肥菇胞內多糖為研究對象，借助小鼠力竭游泳及常壓缺氧模型誘導小鼠產生氧化應激反應，測定并分析實驗小鼠運動及缺氧條件下機體代償代謝的相關生理生化指標，解析柴達木大肥菇多糖抗氧化應激活性與增強機體代謝的關聯機制，為柴達木大肥菇多糖作為天然抗氧化應激功能食品因子的開發和青藏高原珍稀食用真菌資源研發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柴達木大肥菇菌種：青海大學食品科學與工程實驗室保藏，編號CCTCCM-2018250-ZJU-CDMA-12；柴達木大肥菇胞內多糖[Agaricus bitorquis（Quél.）Sacc.intercellular polysaccharides，IPS]：青海大學食品科學與工程實驗室制備。

健康昆明小鼠100只，雄性和雌性各半，小鼠體重為（25±5）g，購自甘肅中醫學院，許可證號為 SCXK（甘）2011-0001。飼養環境適宜、通風、安靜，溫度為18℃～25℃，濕度為35%～50%，實驗所用飲用水、生理鹽水均進行滅菌處理。

紅景天膠囊：北京同仁堂健康藥業股份有限公司；活性炭：上海麥克林生物技術有限公司；三氯甲烷、正丁醇（均為分析純）：天津市博迪化工有限公司；小鼠基礎飼料：江蘇協同生物公司；肝糖原（hepatic glycogen，HG）測定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測定試劑盒、血乳酸（lactic acid，LAC）測定試劑盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）測定試劑盒、一氧化氮（nitric oxide，NO）測定試劑盒、丙二醛（malonic dialdehyde，MDA）測定試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

721N紫外可見分光光度計：上海佑科儀器儀表有限公司；R-1001VN旋轉蒸發儀：鄭州長城科工貿有限公司；SB-3200TDT超聲清洗器：寧波新芝生物科技股份有限公司；各型微量移液器：德國艾本德公司。

1.3 方法

1.3.1 多糖的制備

參考文獻[10]的方法，使用超聲輔助熱水浸提法[水溫 60℃、超聲功率 126 W、料液比 1∶36（g/mL）、提取時間15 min]提取得到胞內粗多糖溶液，在胞內粗多糖溶液中加入溶液體積6%的活性炭[11]，在溫度60℃條件下水浴脫色5 min，褐黃色粗多糖溶液脫色為淺黃色或無色多糖溶液為止。參考文獻[12]中的Sevage法脫除胞內粗多糖溶液中的蛋白。取經過上述處理后的粗多糖溶液，采用大孔樹脂吸附層析法純化[13]，以0.5 mL/min的流速洗脫，得到柴達木大肥菇胞內純化多糖，-80℃凍干后備用。

1.3.2 模型建立與動物分組

通過小鼠力竭游泳和常壓密閉缺氧處理建立氧化應激模型。力竭游泳處理[14]使用小鼠負重游泳的方法，將每組小鼠稱重并進行負重，負重質量為小鼠體重的5%，然后將小鼠分別置于裝有25℃水的桶中，一桶一鼠，記錄小鼠力竭游泳時間；缺氧處理[14]使用常壓密閉缺氧的方法，將每組的10只小鼠，分別放入含有15 g氫氧化鈉的廣口瓶中，在瓶底放一張濾紙，將瓶口用凡士林密封，當各組實驗小鼠停止呼吸，處死并記錄存活時間。所有動物實驗均符合動物倫理學標準。

在滿足無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級要求的動物房，將100只小鼠放入飼養，保證通風且安靜，雌雄分養，提供足夠的基礎飼料和滅菌飲用水，定期清理鼠籠和動物房。適應性喂養后，將小鼠隨機分為柴達木大肥菇胞內多糖低劑量組（intercellular polysaccharides low，IPSL）、中劑量組（intercellular polysaccharides middle，IPSM）、高劑量組（intercellular polysaccharides high，IPSH）、空白對照組（CONTROL）和陽性對照組（RHODIOLA）5個組別。其中低、中、高劑量組是將純化后的胞內多糖，制備成濃度分別為25、50、100 mg/kg的溶液，連續灌胃小鼠35 d；陽性對照組采用紅景天膠囊并參考說明書推薦用量配制成200 mg/kg的灌胃液，按小鼠體重10mg/kg的劑量灌胃，現用現配，連續灌胃35 d；空白對照組以同等體積的生理鹽水進行灌胃。

1.3.3 生理生化指標測定

待小鼠負重游泳結束，撈起小鼠并讓小鼠休息30 min。將小鼠用乙醚麻醉后通過眼球取血，同時將血清分離出來，置于-80℃冰箱中冷藏備用以檢測LAC和BUN含量以及LDH活性。取血后立即將小鼠解剖，取出小鼠肝臟，檢測MDA含量，SOD、CAT和GSH-Px的活性。待小鼠缺氧死亡后，通過眼球取血，摘取小鼠腦組織，迅速將小鼠腦組織放入液氮罐保存備用。之后按照試劑盒操作說明，對小鼠體內MDA、NO、BUN和LAC的含量以及LDH、SOD、CAT和GSH-Px的活性等指標進行測定。

1.4 數據統計分析

通過SPSS 23.0處理數據及其標準差，差異顯著水平為P<0.05，差異極顯著水平為P<0.01；使用Origin（2018 C）軟件制作數據圖；數據以平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 IPS對小鼠力竭游泳時間和缺氧存活時間的影響

IPS對小鼠力竭游泳時間和缺氧存活時間的影響結果見圖1。

圖1 IPS對小鼠力竭游泳時間和缺氧存活時間的影響Fig.1 Effect of IPS on exhaustive swimming time and hypoxia survival time in mice

力竭運動會增加氧氣的攝取和消耗，這會誘發應激源活性氧的大量形成，導致信號傳導異常或細胞功能障礙，會在不同程度上對機體肝臟、骨骼肌等組織造成損傷[15]。小鼠力竭游泳時間是小鼠運動耐力的直接表現，同時也間接反映力竭運動誘導的氧化應激對機體的損傷程度[16]。由圖1A可知，與空白對照組相比，胞內多糖低、中、高劑量組小鼠力竭游泳時間均極顯著延長（P<0.01），分別為 49.48、70.34、92.32 min，隨著劑量增加到100 mg/kg時，小鼠力竭游泳時間延長率達到215.52%；其中胞內多糖低劑量組時間短于陽性對照組，無明顯差異。柴達木大肥菇胞內多糖可以提高小鼠運動耐力，延長力竭游泳時間的結果與較多文獻報道一致，郭俊平等[17]發現桑黃多糖可以延長疲勞小鼠運動時間，延長率為70.62%；曹亮[18]研究發現羊肚菌多糖可以緩解小鼠疲勞狀態，力竭游泳時間延長率達到188.05%。柴達木大肥菇胞內多糖延長小鼠運動耐力效果較為突出，這可能是因為其分子量處于緩解疲勞活性的合適范圍。真菌多糖的分子量過大或者過小均會影響其生物活性功能的表現程度，如果分子量過小，真菌多糖的組成單一，則會無法形成產生活性的聚合結構；如果分子量過大，則分子體積過大，會對多糖跨越多重細胞膜障礙進入生物體內發揮生物活性產生不利影響[19]。而不同的多糖所形成的活性最佳范圍不同，所以會出現不同物種間的差異。

2.1 兩組PDCD4表達率比較 良性對照組44例患者中，40例呈PDCD4陽性表達，陽性表達率為90.91%，EOC組92例患者中，42例呈PDCD4陽性表達，陽性表達率為45.65%。兩組的PDCD4表達水平比較差異有統計學意義(χ2=25.465，P<0.05)。見圖1。

缺氧會誘導機體氧敏感性途徑活化，體內的線粒體電子傳遞系統中可利用的氧氣減少，生成大量自由基，影響機體正常的氧化分解供能作用[20]。小鼠缺氧存活時間常用于評價緩解缺氧的作用[21]，是缺氧所引起的氧化應激反應的觀測指標。由圖1B可知，與空白對照組相比，胞內多糖低、中、高劑量組小鼠缺氧存活時間顯著延長（P<0.05），分別為 46.09、48.53、50.33 min，隨著劑量的增加，小鼠缺氧存活時間呈上升趨勢；胞內多糖干預組和陽性對照組比較時，低劑量組缺氧存活時間短于陽性對照組，無明顯差異，而中、高劑量組缺氧存活時間顯著延長（P<0.05），其中胞內多糖高劑量組是陽性對照組的1.64倍。這與文獻研究結果一致，沙愛龍等[22]研究發現阿里紅多糖可以延長小鼠存活時間至28.12 min，本研究中胞內多糖高劑量組的結果是其1.79倍；曹亮[18]研究發現隨著羊肚菌多糖用量的增加，小鼠缺氧存活時間也隨之延長。以上結果可能是因為每個多糖的分子量不同，而分子量是多糖具備生物活性的關鍵因素，這可能與多糖分子形成的高級構型有關。

綜上可知，柴達木大肥菇胞內多糖可以較好地提高小鼠運動耐力，并且明顯延長小鼠缺氧的存活時間，提高疲勞和缺氧所引起的氧化應激條件下代償代謝水平，表明胞內多糖對氧化損傷小鼠具有較好的保護作用。

2.2 IPS對小鼠氧化應激指標的影響

IPS對小鼠體內SOD、GSH-Px、CAT的活性以及MDA含量的影響結果見圖2。

圖2 IPS對小鼠體內SOD、GSH-Px和CAT活性以及MDA含量的影響Fig.2 Effects of IPS on activities of SOD，GSH-Px and CAT and content of MDA in mice

GSH-Px、SOD及CAT是機體的抗氧化酶系，是常用來評價機體氧化及抗氧化體系是否處于平衡狀態的重要指標[16]。MDA含量變化可以反映細胞膜受損傷的嚴重程度[23]。由圖2A可知，胞內多糖干預組與空白對照組比較，胞內多糖低、中、高劑量組小鼠肝臟中SOD活性增加極顯著（P＜0.01），且隨著胞內多糖劑量的增加，作用效果越明顯；但胞內多糖不同劑量組小鼠肝臟中SOD活性，均低于陽性對照組且無明顯差異。由圖2B可知，與空白對照組相比，胞內多糖低、中劑量組小鼠肝臟中GSH-Px活性差異顯著（P＜0.05），分別達到了15.34、17.08 U/mL，而胞內多糖高劑量組小鼠肝臟中GSH-Px活性差異極顯著（P＜0.01），是空白對照組和陽性對照組的1.63倍和1.35倍；由圖2C可知，相較于空白對照組，胞內多糖低、中、高劑量組小鼠肝臟中MDA含量均極顯著降低（P＜0.01），其中小鼠肝臟中MDA含量隨著胞內多糖劑量的增加而降低，胞內多糖高劑量組含量降至0.55nmol/mg prot，降低了87.81%；由圖2D可知，將胞內多糖3個劑量組與空白對照組進行比較，胞內多糖低、中、高劑量組小鼠肝臟中CAT活性均極顯著增加（P＜0.01），高劑量組小鼠肝臟中CAT活性達到177.05 U/mg prot，是空白對照組的1.34倍，是陽性對照組的1.11倍。本實驗結果與文獻結果相一致，譚秀娟等[24]研究發現蕪根總多糖可以顯著提高缺氧小鼠體內SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量；劉雨萌等[25]研究顯示枸杞子多糖可以有效提高缺氧小鼠體內SOD、GSH-Px活性，降低MDA含量。

綜合表明，柴達木大肥菇胞內多糖可以提升小鼠抗氧化能力，避免MDA的堆積[26]，從而降低氧化損傷，緩解小鼠氧化應激反應。此外，一項針對山參多糖的小鼠抗疲勞實驗發現，山參多糖抑制有害代謝物積累以及減輕氧化損傷，可能與激活腺苷酸激活蛋白激酶（adenosine 5'-monophosphateactivated protein kinase，AMPK）信號通路、改善葡萄糖攝取和線粒體功能有關[27]，這為后續研究相關機制帶來啟發。

2.3 IPS對小鼠血清生化指標的影響

圖3為IPS對小鼠血清中BUN、LAC含量以及LDH活性的影響結果。

圖3 IPS對小鼠血清中BUN和LAC含量、LDH活性的影響Fig.3 Effects of IPS on the contents of BUN，LAC and LDH activity in serum of mice

血乳酸水平和尿素氮含量是對機體有氧代謝能力和疲勞程度的反映[28]。當機體處于疲勞誘導的氧化應激狀態時，機體發生代償代謝不能獲得充沛的能量，所以需要通過加強蛋白質與氨基酸的代謝分解來補充缺失的能量，尿素氮便是此代謝過程的產物，隨著代謝時間的延長其濃度也逐漸升高。LDH活性可以評價機體無氧代謝能力，同時也可以評價機體運動負荷強度和運動損傷程度[29]。由圖3A可知，與空白對照組相比，胞內多糖低、中、高劑量組小鼠血清中BUN含量均顯著降低（P＜0.05），分別下降了 20.57%、44.22%、66.31%，其中胞內多糖高劑量組小鼠血清中BUN含量下降至5.57 mmol/L；與陽性對照組相比，胞內多糖中劑量組小鼠血清中BUN含量顯著下降（P＜0.05），高劑量組極顯著下降（P＜0.01），低劑量組無明顯差異。由圖3B可知，與空白對照組相比，胞內多糖低、中、高劑量組小鼠血清中的血乳酸含量均顯著降低（P＜0.05），且分別下降11.63%、16.64%、38.32%，其中，高劑量組下降效果最為突出；胞內多糖干預組與陽性對照組相比，胞內多糖高劑量組小鼠血清中血乳酸含量下降了23.14%，下降至14.05 mmol/L，血乳酸濃度與機體疲勞程度呈正相關，當機體過度運動后，血乳酸濃度上升從而使機體的疲勞感加劇[30]，如果此時從體外補充抗氧化劑，血乳酸濃度則會下降，從而緩解疲勞癥狀。由圖3C可知，與空白對照組相比，胞內多糖低、中、高劑量組小鼠血清中LDH活性均顯著降低（P＜0.05）；而與陽性對照組相比，低劑量組無顯著差異（P＞0.05），中、高劑量組差異極顯著（P＜0.01）。本研究結果與文獻結果一致，郝艷娟等[30]研究黃瓜籽對小鼠抗疲勞活性發現，黃瓜籽可以減少疲勞小鼠體內BUN和LAC含量，分別降低至4.27 mmol/L和4.49 mmol/L，均能明顯提高疲勞小鼠運動耐力，但本研究結果較低，可能是因為不同原料中營養物質組成不同，黃瓜籽中富含脂肪酸等具有藥用價值的活性成分。譚秀娟等[24]研究發現，蕪根總多糖可以明顯降低疲勞小鼠體內LDH活力，降至17.55 kU/L，這與本研究結果一致，且柴達木大肥菇胞內多糖的作用效果較為突出。

本研究表明，柴達木大肥菇多糖能夠明顯緩解小鼠負重運動造成的疲勞，有效提高小鼠代償代謝水平，且隨著使用劑量的增加，作用效果越突出。多糖可能是通過減少機體因過度運動所引起的代謝產物堆積，從而緩解運動疲勞造成的機體損傷[31]。

2.4 IPS對小鼠腦組織中NO的影響

圖4為IPS對小鼠腦組織中NO含量的影響結果。

圖4 IPS對小鼠腦組織中NO含量的影響Fig.4 Effect of IPS on NO content in brain tissue of mice

當機體處于缺氧所引起的氧化應激狀態時，一氧化氮合酶催化生成的NO可對神經起到毒性作用，造成損傷[32]。由圖4可知，與空白對照組相比，胞內多糖低、中、高劑量組小鼠腦組織中NO含量差異顯著（P＜0.05），與陽性對照組相比，低劑量組無明顯差異，中、高劑量組差異極顯著（P＜0.01）。人體腸道內棲息著多種共生微生物，統稱為腸道菌群，其在盲腸和大腸中幫助人體發酵食用菌多糖等多種膳食纖維，產生的益生代謝產物短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFA），能夠影響人體的代謝、免疫和神經等多個系統，其中丁酸鹽被證實是中樞神經系統中重要的神經調節劑[33]。與本文結果相似，Lanza等[34]發現炎癥小鼠補充丁酸鹽后脊髓組織的NO水平明顯降低，并推測是通過抑制核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號通路下游促進誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的表達實現，也有另一項研究表明丁酸鹽能夠抑制NF-κB信號通路的激活，從而降低腎病小鼠的腎臟氧化損傷[35]，基于此，推測柴達木大肥菇多糖同樣可能通過結腸發酵產生丁酸鹽的方式，影響腦組織中的NF-κB信號通路進而降低NO含量。

3 結論

本文研究結果顯示，疲勞和缺氧可以明顯加劇小鼠的氧化應激過程，引起小鼠抗氧化能力下降。通過氧化應激損傷動物實驗評價發現，25、50、100 mg/kg劑量的柴達木大肥菇胞內多糖均能不同程度提高小鼠的抗氧化能力，緩解小鼠由疲勞和缺氧誘發的氧化損傷，改善小鼠氧化應激程度，從而對小鼠產生保護作用。柴達木大肥菇胞內多糖組小鼠力竭游泳時間和缺氧存活時間均有所延長，且呈劑量依賴性；肝臟抗氧化結果顯示，胞內多糖低、中、高劑量組明顯降低了肝臟中MDA含量，升高了SOD、CAT和GSH-Px 3種抗氧化酶的活性，說明不同劑量的胞內多糖對肝臟的抗氧化能力均有增強作用。血清指標檢測結果顯示，胞內多糖低、中、高劑量組能夠降低小鼠血清中LDH活性、BUN含量和LAC含量，說明柴達木大肥菇胞內多糖可以降低機體由于運動損傷所引起的代謝產物積累，從而有效緩解過度運動造成的氧化損傷，提高疲勞狀態下代償代謝水平，起到保護機體的作用，具有抗氧化應激活性。

以上結果說明，柴達木大肥菇胞內多糖可以作為天然的抗氧化劑，具有顯著的抗氧化應激活性，可以清除機體中多余的活性氧自由基，有效改善機體的氧化和抗氧化體系之間不平衡的狀態，逆轉抗氧化體系中酶類的活性，維持線粒體內氧化磷酸化的正常進行，提高機體抗疲勞和缺氧耐受性。關于柴達木大肥菇胞內多糖的抗氧化應激活性具體的作用機制、信號通路等需要進一步研究。后期可以借助組學技術對內源性抗氧化信號通路進行研究，從多因子、多信號通路復雜調控機體內在平衡的角度，對深層的機制進行更系統、更全面的分析，闡明柴達木大肥菇多糖發揮作用的深層機制。本實驗為柴達木大肥菇多糖在食品、藥品領域的應用提供了一定的理論參考。