我國不同產地黨參指紋圖譜分析比較

黃延盛，張欣，劉耀軍，胡流云，王長虹，王崢濤，黃曉君

（1.無限極（中國）有限公司，廣東 廣州 510623；2.上海中藥標準化研究中心，上海 201203；3.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室，中國-加拿大食品科學與技術聯合實驗室，江西省生物活性多糖實驗室，江西 南昌 330047）

黨參屬（Codonopsis）隸屬桔梗科（Carnpanulaceae），全屬共40余種，我國有39種。野生黨參主要分布于西南各省區，栽培黨參則主產于西北、華北地區[1]。本屬植物黨參 [Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.]、素花黨參[C.pilosula var.modesta（Nannf.）L.T.Shen]及川黨參（C.tangshen Oliv.）為2010版《中國藥典》收錄品種，其干燥根作為黨參入藥，具有補中益氣、健脾益肺功效[2-4]，可用于治療脾肺虛弱、氣短心悸、食少便溏、虛喘咳嗽、內熱消渴等癥[5-6]。黨參屬大多種類的根部均具有藥用價值，一些種類如管花黨參（C.tubulosa Kom.）、球花黨參（C.subglobosa Srnith.）、灰毛黨參（C.canescens Nannf.）、新疆黨參[C.clematidea（Schrenk）Clarke.]等在臨床上也作為黨參使用。現代研究表明，黨參多糖具有保護胃黏膜、調節人體免疫、改善胃腸炎癥等作用[7-9]。

在《中國藥典》2010年版（一部）中，黨參只有醇溶性浸出物、薄層定性鑒別等指標，無法全面評價和控制黨參質量。有研究以薄層掃描法測定黨參中甾類或三萜類成分來控制黨參質量，但甾類或三萜類成分不是黨參特有成分，缺乏專屬性。現有關于黨參甙I的研究，主要集中在山西產黨參，缺乏對多產地品種進行系統全面研究，難以成為表征黨參質量的指標[10]。蒼術內酯III只存在于黨參（C.pilosula）中，素花黨參（C.Pilosula var.modesta）和川黨參（C.tangshen）中則不含有此成分，而在菊科、金粟蘭科中有分布，不能全面準確反映《中國藥典》收錄的黨參類種類的質量。黨參炔苷在黨參類種間、產地間相差懸殊。通過黨參指紋圖譜，可對不同品種和不同產地黨參的質量進行快速定性分析。此外，對黨參中黃酮類、氨基酸和微量元素的含量以及揮發油的組分和含量進行測定，同樣因缺乏專屬性或尚未建立穩定可靠的方法也不能作為黨參定性、定量的依據[11-12]。因此建立一種有效的方法來控制黨參質量顯得尤為重要[13]。

黨參的指紋圖譜[14]已有眾多報道，主要集中在黨參炔苷（lobetyolin）、蒼術內酯 III（atractylenolide III）等成分，而且多采用高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography，HPLC）進行指紋圖譜的建立，分析時間一般在60 min以上，很少采用超高速液相色譜儀（ultra performance liquid chromatography，UPLC）進行黨參指紋圖譜分析[15-16]。本研究通過超高速液相色譜儀[17]對不同產地不同品種黨參進行指紋圖譜分析，在黨參指紋圖譜的基礎上，生成具有9個特征峰的黨參特征圖譜，采用相似度分析、主成分分析對特征圖譜進行評價。通過對主要產地和品種黨參指紋圖譜的分析及比較，為后續選擇適宜品種黨參作為食品或加工原料提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

35批黨參主要來源于甘肅、貴州、山西、湖北、重慶黨參主產區，經上海中藥標準化研究中心吳立宏研究員鑒定，其性狀與2015年版《中國藥典》所規定的黨參一致，鑒定為正品。具體信息見表1。

表1 黨參信息匯總Table 1 Information of Codonopsis pilosula

續表1 黨參信息匯總Continue table 1 Information of Codonopsis pilosula

乙酸乙酯、甲醇（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；乙腈、甲醇、甲酸（均為色譜純）：美國Fisher公司；紫丁香苷標準品、阿魏酸標準品、蒼術內酯III標準品（純度均≥98%）：上海中藥標準化研究中心；黨參炔苷標準品（純度≥98%）：成都瑞芬思生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

KQ-250DB數控超聲波清洗儀：江蘇昆山市超聲儀器有限公司；DFT-50型手提式高速粉碎機：溫嶺市林大機械有限公司；RE-56旋轉蒸發儀：上海愛朗儀器有限公司；PB203-N電子天平：上海分析儀器廠；PBL-M型離心機：上海菲恰爾分析儀器有限公司；METTLER200型電子天平：瑞士METTLER TOLEDO公司；Waters ZQ 2000型單四極桿質譜儀（Masslynx V4.1色譜工作站包，Waters Acquity PDA二極管陣列檢測器）、Acquity UPLCHSS T3 C18色譜柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）：美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

黨參共35份樣本，從每份樣本中挑選200 g無霉變、外觀良好的黨參用粉碎機粉碎，過3號篩備用。

1.3.2 黨參主要成分測定

1.3.2.1 標準液的配制

分別稱取紫丁香苷、阿魏酸、黨參炔苷、蒼術內酯III 4 種黨參標準品 6.32、10.12、8.14、9.67 mg，使用純化水溶解后分別定容于25 mL容量瓶中作為貯備液，貯備液濃度分別為紫丁香苷0.252 8 mg/mL、阿魏酸0.404 8 mg/mL、黨參炔苷0.325 6 mg/mL、蒼術內酯III 0.386 8 mg/mL。吸取適量上述4種標準品貯備液于50 mL容量瓶中，作為稀釋一系列不同濃度標準溶液的原液。

1.3.2.2 進樣前處理

精密稱取黨參粉末置于100 mL具塞錐形瓶中，加入20 mL乙酸乙酯，超聲輔助提取（功率250 W、頻率40 kHz）30 min后過濾，收集乙酸乙酯提取液，置于25 mL梨形燒瓶中，減壓濃縮至干；沉淀再加80%甲醇溶液，超聲輔助提取（功率250 W、頻率40 kHz）50 min；收集醇提液，置于同一25 mL梨形燒瓶中，減壓濃縮至干，加甲醇溶解并轉移至5 mL容量瓶中，過0.22 μm濾膜，取續濾液進樣至UPLC，進樣量5 μL。

1.3.2.3 色譜條件

流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水（B）。梯度洗脫：0～14 min，0.5%～20%（A）；14 min～18.5 min，20%～30%（A）；18.5 min～23 min，30%～50%（A）；23 min～30 min，50%～98%（A）；30 min～32 min，98%（A）；32 min～34 min；98%～0.5%（A）。流速0.2 mL/min、柱溫30℃、檢測波長240nm。

1.4 數據分析

采用國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統”（2004A版）軟件對35批的指紋圖譜進行相似度分析。采用SIMCA13.0統計學分析軟件進行主成分分析。

2 結果與分析

2.1 黨參指紋圖譜檢測方法建立

選取色譜圖中12個具有代表性且分離度良好的色譜峰，其中3個色譜峰為已確認的紫丁香苷、黨參炔苷、蒼術內酯III，其余9個色譜峰以出峰時間（6.38、6.67、8.19、13.75、15.72、16.18、17.64、17.87、19.27 min）為標記對象。

2.1.1 穩定性試驗結果

取 S12 樣品分別于 0、1、2、4、8、12、24、36 h 進樣檢測。以黨參炔苷色譜峰（7號峰）為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間、相對峰面積，結果見表2。

表2 素花黨參（S12）、川黨參（S28）、黨參（S29）穩定性試驗相對保留時間、相對峰面積Table 2 Relative retention schedule and peak area of stability experiment of Codonopsis pilosula var.mdesta（S12），C.tangshen（S28）and Codonopsis pilosula（S29）

由表2可知，各共有峰的相對保留時間、相對峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）均小于3%（n=6）。表明供試品溶液穩定性良好。

2.1.2 精密度試驗結果

分別取供試品溶液S12、S28、S29，連續進樣6次，記錄色譜圖。以黨參炔苷（7號峰）為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間、相對峰面積，結果見表3。

表3 素花黨參（S12）、川黨參（S28）、黨參（S29）精密度試驗相對保留時間、相對峰面積Table 3 Relative retention schedule and peak area of precision experiment of Codonopsis pilosula var.mdesta（S12），C.tangshen（S28）and Codonopsis pilosula（S29）

由表3可知，各共有峰的相對保留時間、相對峰面積RSD均小于3%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.1.3 重復性試驗結果

分別精密稱取6份S12、S28、S29黨參樣品粉末，按1.3.2.2方法制備樣品溶液。液相進樣檢測，記錄色譜圖。以黨參炔苷色譜峰（7號峰）為參照峰，計算各共有峰的相對保留時間、相對峰面積，結果見表4。

表4 素花黨參（S12）、川黨參（S28）、黨參（S29）重復性試驗相對保留時間、相對峰面積Table 4 Relative retention schedule and peak area of replication experiment of Codonopsis pilosula var.mdesta（S12），C.tangshen（S28）and Codonopsis pilosula（S29）

由表4可知，各共有峰的相對保留時間、相對峰面積RSD均小于3%（n=6），表明檢測方法重復性良好。

2.2 相似度分析

2.2.1 素花黨參、川黨參和黨參相似度分析

采用中位數法，以S12為參照譜，生成素花黨參對照指紋圖譜；以S28為參照譜，生成川黨參對照指紋圖譜，以S29為參照譜，生成黨參對照指紋圖譜。素花黨參對照指紋圖譜中確定7個特征峰，生成素花黨參特征圖譜。川黨參對照指紋圖譜中確定6個特征峰，生成川黨參特征圖譜。黨參對照指紋圖譜中確定5個特征峰，生成黨參特征圖譜，具體結果見圖1。

圖1 相似度分析圖譜Fig.1 Similarity analysis atlas

以S12為參照譜，對35批黨參樣品的指紋圖譜進行相似度分析，結果見表5。

表5 35批樣品相似度分析結果Table 5 Similarity analysis results of 35 batches of samples

續表5 35批樣品相似度分析結果Continue table 5 Similarity analysis results of 35 batches of samples

由表5可知，3種黨參整體相似度在0.35～0.85，35批樣品相似度差異較大，說明3種黨參指紋圖譜之間差異較大，有必要分別對其進行相似度分析。

2.2.2 素花黨參（C.pilosula.var.modesta）相似度分析

以S12為參照譜，對19批黨參樣品色譜圖進行相似度分析，19批素花黨參整體相似度范圍在0.36～0.87，存在較大種間差異，原因可能是19批樣品產自不同產地[18]。甘肅省文縣的素花黨參（S1、S2），甘肅省渭源縣不同村落的白條黨參（S4～S10），指紋相似度均在0.6～0.7之間，證明產自同一產區指紋相似度較高；樣品S13和S14產自同一黨參實驗基地，使用壯根靈的14號樣品相似度（0.65）較未使用壯根靈13號樣品相似度（0.52）高，說明使用壯根靈對黨參的生長有促進作用。

鑒于19批素花黨參批間一致性較差，因此對19批素花黨參進行批間主成分分析，19批樣品的偏最小二乘法判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA）見圖 2。

圖2 素花黨參樣品主成分分析PLS-DA圖Fig.2 Principal component analysis（PLS-DA）of Codonopsis pilosula var.mdesta

由圖2可知，19批素花黨參主要被分為3組，產自貴州省遵義市陽溪鎮的S11樣品進行了單獨分類，其余的樣品分居Y軸兩側，較密集區域多產自甘肅省渭源縣黨參十里鎮示范園試驗田及農民專業合作社；也有產自甘肅省渭源縣不同村落的白條黨，如S5、S6、S7、S8，說明素花黨參也存在組內差異，這是造成素花黨參間整體相似度不高的主要原因。

2.2.3 川黨參（C.tangshen）相似度分析

以S20為參照譜，對9批川黨參色譜圖進行相似度分析，9批川黨參的整體相似度不高，取值在0.47～0.80。S20～S24產自湖北省恩施板橋鎮的不同村落，S25、S26分別為來自重慶巫山的廟黨，其中S25為主根，S26為須根，二者在7號峰的含量上存在差異，須根（S26）為主根（S25）的兩倍左右，說明此物質多集中于須根生長；S27、S28分別為產自湖北省恩施市的精裝白條黨參和精裝毛條黨參；其中3號峰為S28獨有，含量約為0.12 mg/g，較其他色譜峰含量適中。川黨參的另一個特點是蒼術內酯III的含量較素花黨參低，生長年限4～5年的川黨參幾乎不含蒼術內酯III，只有生長年限為2年的樣品S23含有極少的蒼術內酯III（低于千分之一），這說明蒼術內酯III不是川黨的特征峰，含量與生長年限也有一定的相關性，生長年限越久，蒼術內酯III含量越低。

相似度分析結果表明：川黨作為黨參基源的一種黨參，與其他品種黨參區別明顯，有必要對其分別進行質量控制。所建立的特征圖譜對其具有鑒別意義[19]。

圖3為9批川黨參成分的主成分分析。

圖3 川黨參樣品主成分分析PLS-DA圖Fig.3 Principal component analysis（PLS-DA）of C.tangshen

由圖3可知，9批川黨參被聚為2類，其中樣品S26為產自重慶巫山的廟黨，S27為湖北恩施的精裝白條黨，其余批次主要來自湖北恩施的板黨，一致性較好，被聚為一組。

2.2.4 黨參（C.pilosula）相似度分析

以S29為參照譜，對7批黨參進行相似度分析，7批黨參的整體相似度不高，取值在0.48～0.79。樣品S29～S32產自同一產地，S29和S30為對照，未施農藥S29蒼術內酯III的含量超過施過農藥S30的3倍，推測農藥的使用對蒼術內酯III的含量也有一定的影響，農藥的使用量越大，蒼術內酯III的含量越低。S33為野生黨參，此樣品色譜信息最為豐富，因此相似度也最低，僅為 0.48（S29為參照譜）。黨參（C.pilosula）指紋圖譜與素花黨參（C.pilosula.var.modesta）指紋圖譜較為相似，主要差異是素花黨參存在2號峰和4號峰（丁香苷），并且這兩個物質在素花黨參中含量也相對較少，因此僅以相似度分析很難區分黨參（C.pilosula）和素花黨參（C.pilosula.var.modesta），需進一步進行聚類分析和主成分分析[20]。

對7批產自山西省陵川縣以及貴州威寧的黨參（C.pilosula）進行主成分分析，結果見圖4。

由圖4可知，樣品S33和S35在進行數據分析分析時缺少色譜信息，而未被納入數據分析中，因此缺少分組信息。可以發現產自山西的這幾批黨參（C.pilosula）被分為了兩類，其中S29和S30為一組對照組，二者一致性較好，其余批次黨參（C.pilosula）較離散。

圖4 黨參樣品主成分分析PLS-DA圖Fig.4 Principal component analysis（PLS-DA）of Codonopsis pilosula

2.3 主成分分析

以 35批黨參（C.pilosula）、素花黨參（C.pilosula.var.modesta）、川黨參（C.tangshen）樣品為研究對象，以黨參炔苷為參照峰，將各特征峰相對峰面積作為原始數據矩陣，結果見圖5。

由圖5A可知，35批樣品主要聚為3類，川黨參（C.tangshen）均位于 X 軸左側，而黨參（C.pilosula）和素花黨參（C.pilosula.var.modesta）均位于X軸右側，黨參（C.pilosula）居Y軸右上方，素花黨參（C.pilosula.var.modesta）居 Y 軸右下方；9批川黨參（C.tangshen）分布較為緊密，只有28號樣品較為離散，究其原因是28號樣品有一獨特的3號色譜峰，被歸到了素花黨參（C.pilosula.var.modesta）的區域；素花黨參（C.pilosula.var.modesta）較為離散，樣品種間差異較大；S16（十里鎮）離其余素花黨參較遠。7批黨參（C.pilosula）分布也較為離散，其中33號樣品偏離較遠，原因在于33號樣品是35批中唯一一批野生黨參，其1、5、7、9號特征峰較同批次的黨參（C.pilosula）含量高；并且色譜保留時間在14 min～20 min的色譜信息非常豐富，這與指紋相似度結果一致。由圖5B可知，6號峰、1號峰、5號峰的VIP值均大于1.0。其中，6號峰為川黨（C.tangshen）參特征峰，1號峰和5號峰為三者共有峰，這些峰對黨參（C.pilosula）、素花黨參（C.pilosula.var.modesta）、川黨參（C.tangshen）的分類具有顯著性。

圖5 黨參樣品主成分分析結果Fig.5 Principal component analysis of Codonopsis pilosula

3 結論

本文對我國主要黨參產區（甘肅、貴州、山西、湖北、重慶）的不同品種（黨參C.pilosula；素花黨參C.pilosula var.mdesta；川黨參C.tangshen）黨參分別建立了3種基源黨參的指紋圖譜。同時對3種基源黨參的相似度進行了研究分析。結果表明，3種基源黨參的相似度跨度范圍均較大，說明在不同產地的同一品種黨參化學成分含量及種類變化較大。主成分分析表明，湖北恩施產川黨參分布較為集中，批間一致性較好。而黨參和素花黨參批間差異較大，這和種植范圍廣有一定的關系。通過對主要產地和品種黨參指紋圖譜的分析及比較，為后續選擇適宜品種黨參作為食品或加工原料時提供一定的理論參考。