半枝蓮莖中黃酮類化合物提取及抗氧化分析*

張磊 梁雅麗 郭鈞

1（忻州師范學院,山西忻州 034000）

2（山西省生物研究院有限公司,山西太原 030006）

3（上海微譜化工技術服務有限公司，上海寶山 201900）

半枝蓮（Scutellaria Barbata D.Don）又名通經草，為唇形科黃芩屬多年生草本植物，可抗癌，亦可清熱解毒和消炎抑菌等。這些功能離不開黃酮類、二萜類、生物堿類等活性成分，其中黃酮類物質已在很多藥對組方中作為主要成分而發揮作用。2010 版《中華人民共和國藥典》規定總黃酮含量為半枝蓮藥材的檢測指標之一。

目前對半枝蓮的研究主要集中在化學成分分析與藥理相關作用研究方面，多數以半枝蓮藥用部分為研究對象，但是對植株中單一活性成分研究尚淺，特別是黃酮類化合物。因此，本研究以半枝蓮莖為研究對象，比較纖維素酶法和堿性電解水提法提取總黃酮的差異，并進行抗氧化分析，獲得較優提取工藝，為半枝蓮的開發利用提供數據參考。

1 材料與方法

1.1 研究材料

半枝蓮藥材，購自北京同仁堂太原分店，經山西省生物研究院有限公司岳建英研究員鑒定，為半枝蓮的干燥全草。

1.2 試驗方法

1.2.1 提取工藝流程

堿性電解水提法和纖維素酶法提取工藝參考段宙位等的方法。黃酮質量濃度的測定參考Zhang 的方法。

1.2.2 纖維素酶法

采用纖維素酶輔助有機溶劑提取半枝蓮莖中黃酮類化合物，考察了乙醇體積分數、酶解溫度、pH值、底物質量濃度、酶添加量和酶解時間6 個因素對半枝蓮莖總黃酮得率的影響。

1.2.3 堿性電解水浸提法

采用堿性電解水浸提法提取半支蓮莖中黃酮類化合物，考察乙醇體積分數、提取溫度、料液比和提取時間4 個因素對總黃酮得率的影響。

1.2.4 提取物體外抗氧化性比較

對2 種方法提取的半枝蓮莖黃酮類物質的抗氧化性進行比較。參考Wu 等的方法測定ABTS 自由基清除作用，Wang 等方法測定DPPH 自由基清除作用。

2 結果與分析

2.1 纖維素酶法提取半枝蓮莖黃酮

在其他條件下的情況下，分別考察乙醇體積分數，酶解溫度、底物pH 值、底物質量濃度、酶添加量、酶解時間對半枝蓮莖黃酮得率的影響，結果見圖1～圖6。

圖1 乙醇體積分數對黃酮得率的影響

由圖1 可知，隨著乙醇體積分數的增加，總黃酮得率呈現先升高后降低的變化趨勢，在乙醇體積分數為80%時黃酮得率為最高。這可能因為受提取材料等因素的影響，植株中黃酮在乙醇體積分數為80%條件下較易溶出，提取溶劑達到了一種較為理想的溶出體系，而其他體積分數的乙醇溶液則有可能改變了該溶解體系。由圖2 可知，酶解溫度為60℃時黃酮得率最高，這可能是因為在60 ℃下纖維素酶活性最強，分解相關底物的效率最高，而其余提取溫度下酶活性沒有達到最高值，故酶促反應沒有達到最佳狀態。由圖3 可知，pH 值為5 時黃酮得率最高，這可能是因為該酸堿值下酶活性最強，而其他pH 值會導致酶活性的下降，使得纖維素分解速率降低，不利于黃酮類物質的浸出。由圖4 可知，當底物質量濃度為30 g/L 時，黃酮提取效果最佳，隨著底物質量濃度增加，黃酮提取得率開始下降，可能是底物質量濃度的增加使提取溶劑對底物的溶解程度下降所致，使得黃酮浸出效率降低。由圖5 可知，酶添加量為400 U/g 時黃酮得率最高，達到了1.23%，減少或增加酶添加量，黃酮得率均出現下降。由圖6 可知，當提取時間為2 h 時黃酮得率最高，達到了1.66%，當增加或減少提取時間時，黃酮得率均出現下降。

圖2 酶解溫度對黃酮得率的影響

圖3 底物pH 值對黃酮得率的影響

圖4 底物質量濃度對黃酮得率的影響

圖5 酶添加量對黃酮得率的影響

圖6 酶解時間對黃酮得率的影響

2.2 堿性電解水提法提取半枝蓮莖黃酮

在其他條件不變的情況下，分別考察乙醇體積分數、提取溫度、料液比、提取時間對半枝蓮莖黃酮的提取效果，測定結果分別見圖7～圖10。

圖7 乙醇體積分數對黃酮得率的影響

由圖7 可知，使用堿性電解水提取黃酮時，乙醇體積分數為70%時黃酮得率最高，改變乙醇體積分數后提取效果呈下降趨勢，可能與一定體積分數的乙醇所形成的極性環境有關，乙醇體積分數發生變化后一些其他成分干擾了黃酮類成分的浸出。由圖8 可知，在提取溫度為55 ℃的條件下，黃酮得率達到了0.85%，為最高值。當溫度高于或低于55 ℃時，黃酮提取效果均發生了下降，這可能與該溫度下黃酮在堿性電解水中的擴散作用比較好有關。溫度過高易引起黃酮類物質的降解或者氧化還原反應。由圖9 可知，隨著料液比的增加，黃酮得率呈現出先上升后下降的趨勢，在料液比為1 g∶20 mL時黃酮得率達到了最高值，為1.24%。說明在該料液比條件下黃酮浸提的效率最高，相關物質溶出比較徹底。由圖10 可知，提取時間的變化趨勢與料液比相似，表現為隨著時間延長，得率先上升后下降，在2 h 達到最佳得率。當提取時間超過2 h 后，一些成分開始發生降解，使得產物得率下降。

圖8 提取溫度對黃酮得率的影響

圖9 料液比對黃酮得率的影響

圖10 提取時間對黃酮得率的影響

2.3 清除ABTS 自由基能力比較

對2 種方法提取的黃酮類物質清除ABTS 自由基的能力進行比較，結果如圖11 所示。

圖11 2 種方法提取的黃酮浸提物清除ABTS 能力比較

由圖11 可知，2 種方法獲得的黃酮類物質均可清除ABTS 自由基，且清除率與總黃酮質量濃度先表現為正相關，之后轉為負相關。纖維素酶輔助提取半枝蓮莖中黃酮浸提物和堿性電解水提取半枝蓮莖中黃酮浸提物清除ABTS 自由基能力的最高值分別為29.15%和15.69%，說明堿性電解水提法獲得的黃酮類物質清除ABTS 自由基能力較弱，這可能與提取產物中黃酮的純度不同有關。

2.4 清除DPPH 自由基能力比較

對2 種方法提取的黃酮類物質清除DPPH 自由基的能力進行比較，結果如圖12 所示。

圖12 2 種提取方法的黃酮浸提物清除DPPH 能力比較

由圖12 可知，2 種方法獲得的黃酮類物質均可清除DPPH 自由基，且清除率與總黃酮質量濃度先表現為正相關，之后轉為負相關。纖維素酶輔助提取和堿性電解水提取黃酮類物質的清除DPPH 自由基分別達到34.84%和19.21%，說明纖維素酶提取產物清除DPPH 自由基能力較強。

3 結論

黃酮類化合物是半枝蓮莖中的主要活性成分之一。本研究采用纖維素酶法和堿性電解水浸提法2種方法，以半枝蓮莖為試驗材料，獲取較優的黃酮類化合物提取工藝。結果表明，針對半枝蓮莖樣品，纖維素酶法的較優工藝條件為：乙醇體積分數80%，酶添加量400 U/g，底物質量濃度30 g/L，酶解溫度60 ℃，pH值5.0，酶解時間2 h；堿性電解水浸提法的較優工藝條件為：乙醇體積分數70%，料液比1 g∶20 mL，提取溫度55 ℃，提取時間2 h。

纖維素酶法提取的黃酮類物質清除ABTS 和DPPH 自由基的能力均高于堿性電解水法，即抗氧化性強于堿性電解水提法獲得的黃酮類物質。綜上所述，對于半枝蓮莖中黃酮的提取，纖維素酶輔助提取法較為適宜。堿性電解水在提取和純化某些蛋白質以及去除農產品農藥殘留方面顯示出一定的優越性，目前以堿性電解水為溶劑浸泡中草藥來提取有效成分的研究比較少見，同一種草藥用不同溶劑和提取方法可能獲得不同的有效成分，采用堿性電解水浸提或洗脫，從提取成本、環保以及獲取某種化合物的角度考慮，是值得探索和開發的。此外，還需要對黃酮類化合物的生物活性及其功能特性進行考察和評價。