Folin-Ciocalteu 比色法測(cè)定沙棘葉中多酚的含量*

田建華

（山西省林業(yè)和草原科學(xué)研究院，國家林草局沙棘工程技術(shù)研究中心，山西太原 030024）

沙棘（Hippophae rhamnoides）是胡頹子科落葉灌木或喬木，同時(shí)也是國內(nèi)公認(rèn)的藥食同源植物。目前沙棘產(chǎn)品的開發(fā)主要是應(yīng)用沙棘果實(shí)榨汁、沙棘籽榨油，沙棘葉一般作為廢棄物被遺棄，造成了很大的資源浪費(fèi)，然而沙棘葉富含維生素、黃酮類化合物、多糖等多種生物活性物質(zhì)，具有顯著的生化藥理活性和保健作用，在制茶方面具有巨大的應(yīng)用潛力。多酚作為其活性物質(zhì)的一種，具有很強(qiáng)的抗氧化活性，同時(shí)在降血糖、抗腫瘤、保護(hù)心血管等方面具有一定的功效。目前對(duì)沙棘葉中多酚的研究主要集中在提取及應(yīng)用方面，如馬正才等比較了醇提法和微波輔助醇提法提取的甘南沙棘葉中茶多酚含量，發(fā)現(xiàn)微波法提高了沙棘葉中茶多酚得率，且明顯縮短提取時(shí)間；冉麗梅等對(duì)沙棘葉中的活性成分進(jìn)行研究，結(jié)果表明沙棘葉制成的紅茶中多酚含量最豐富，說明沙棘葉茶是一種富含茶多酚的保健茶。但是文獻(xiàn)對(duì)沙棘葉多酚含量測(cè)定方法的評(píng)價(jià)研究較少。本試驗(yàn)參考GB/T 8313—2018《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》、T/AHFIA 005—2018《植物提取物及其制品中總多酚含量的測(cè)定分光光度法》中多酚含量的測(cè)定方法，在此基礎(chǔ)上對(duì)測(cè)定方法進(jìn)行改進(jìn)，同時(shí)進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，旨在確定適用于沙棘多酚含量的測(cè)定方法，為建立和完善沙棘多酚的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系提供可靠的方法和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與儀器

沙棘葉，采自陽曲、和順、右玉等地；茶葉，市售。

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，CAS 號(hào)∶ 149-91-7，成都曼斯特生物制品有限公司；福林酚、碳酸鈉、甲醇、乙醇等，均為分析純。

冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物有限公司；JYL-C020E 粉碎機(jī)，九陽股份有限公司；精密分析天平，梅特勒托利多；HH 數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國宇儀器制造有限公司；KQ-200VD 雙頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SC-3610 低速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；Infinite M Nano 酶標(biāo)儀，瑞士TECAN（帝肯）。

2 試驗(yàn)方法

2.1 材料預(yù)處理

將新鮮沙棘葉置于-80 ℃超低溫冰箱，3 d 后取出置于冷凍干燥機(jī)中，冷凍干燥，粉碎，過60目篩，備用。

2.2 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取一定量的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品于小燒杯中，用甲醇溶解后轉(zhuǎn)移至容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。準(zhǔn)確量取沒食子酸儲(chǔ)備液0.0 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.30 mL、0.40 mL、0.50 mL、0.60 mL 分別置于容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，得質(zhì)量濃度為0.0ug/mL、10.0ug/mL、20.0ug/mL、30.0ug/mL、40.0ug/mL、50.0ug/mL、60.0ug/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列工作液。

準(zhǔn)確吸取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)系列工作液各1 mL，置于刻度試管中，每個(gè)試管內(nèi)分別加入5.0 mL 20%福林酚試劑，搖勻后反應(yīng)8 min，加入4.0ug/mL10%碳酸鈉溶液，超聲提取，超聲條件為：超聲溫度35 ℃，超聲頻率45 kHz，超聲功率80 W，超聲10 min 后靜置，如此反復(fù)提取3 次，取出，冷卻至室溫，于760 nm 波長處，測(cè)定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取100 mg 沙棘葉材料，置于錐形瓶中，加入40 mL 熱蒸餾水，超聲處理（溫度32 ℃，功率160 W，頻率45 kHz）20 min，取出，離心，過濾，殘?jiān)性偌尤?0ml 熱水，超聲處理，條件同前，重復(fù)2 次，合并3 次濾液，加蒸餾水定容至刻度，搖勻，得供試品溶液。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密量取1 mL 供試品溶液6 份，置刻度試管中，按照2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法操作，以相應(yīng)試劑為空白，于760 nm 波長處測(cè)定吸光度，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密量取供試品溶液1 mL，置于刻度試管中，按照2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法操作，以相應(yīng)試劑為空白，分別于10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、240 min 時(shí)，測(cè)定其在760 nm 處的吸光度，并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值。

2.6 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精密稱取已知多酚含量的沙棘葉材料，置于錐形瓶中，按照2.3 供試品溶液制備方法操作。將供試品溶液分為3 組，每組3 份，置錐形瓶中，分別加入相當(dāng)于試樣量80%、100%、120%的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法操作，以相應(yīng)試劑為空白，于760 nm 波長處測(cè)定吸光度，計(jì)算試樣的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值。

2.7 多酚含量測(cè)定

按2.3 所述方法，精密稱取樣品100 mg，制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液1 mL，置刻度試管中，然后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟執(zhí)行。以相應(yīng)試劑為空白，于760 nm 波長處測(cè)定吸光度，計(jì)算試樣中多酚的含量。

按標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算試樣中多酚含量（以沒食子酸計(jì)）。計(jì)算公式如下：

式中：X—試樣中多酚的含量，g/100g；

c—反應(yīng)混合物中多酚的量，μg/mL；

V—待測(cè)樣液總體積，mL；

V1—樣液反應(yīng)體積，mL；

V2—樣液反應(yīng)后總體積，mL；

m—樣液所代表的試樣質(zhì)量，mg。

3 結(jié)果與分析

3.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1 所示。由圖1 可知，以沒食子酸為校正標(biāo)準(zhǔn)，測(cè)定的吸光度為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用最小二乘法得到回歸方程為Y=0.011 2X+0.0137，其相關(guān)系數(shù)R2=0.999 3，符合朗伯-比爾定律，表明樣品質(zhì)量濃度在10μg/mL～60μg/mL 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

3.2 重復(fù)性試驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表1 可知，供試品溶液的吸光度均值為0.294 2，RSD值為1.44%(n=6)，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

沙棘葉多酚穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表2。穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在70 min 內(nèi)供試品溶液的吸光度保持穩(wěn)定，放置4 h 時(shí)的吸光度值有所下降，因此顯色后應(yīng)在70 min 內(nèi)測(cè)定吸光度。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3.4 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

方法的加標(biāo)回收率試驗(yàn)結(jié)果見表3。由表3 可知，3 個(gè)添加水平的平均回收率分別為98.40%、104.08%、102.23%，均在95%～105%之間，且RSD值均小于5%，表明該方法在系統(tǒng)誤差范圍內(nèi)，可以作為沙棘葉多酚含量的測(cè)定方法。

表3 加標(biāo)回收率

3.5 沙棘葉及茶中多酚含量的測(cè)定

采用新方法測(cè)定沙棘葉及茶中多酚含量，結(jié)果表明，沙棘葉和幾種茶中多酚總量各不相同，沙棘葉中多酚含量為7.99%～14.69%，均高于沙棘茶、紅茶（大紅袍），有些試樣的多酚含量超過綠茶（碧螺春），這可能是原材料、制茶工藝不同而引起多酚含量的不同。可能在茶葉加工過程中，發(fā)生茶多酚酶促氧化反應(yīng)，生成了茶黃素、茶紅素等其他成分，而導(dǎo)致茶多酚的減少。茶多酚是決定茶葉色、香、味的主要成分，同時(shí)是茶葉中的主要功效成分，具有多種保健作用。沙棘葉富含多酚，作為茶具有較高的利用價(jià)值，但目前市場上沙棘茶產(chǎn)品還比較少見，今后作為茶原料的沙棘資源培育及深加工技術(shù)還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

試驗(yàn)結(jié)果表明，在最大吸收波長760 nm 處，沒食子酸質(zhì)量濃度在10μg/mL～60μg/mL 范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好，該方法重復(fù)性、穩(wěn)定性好，回收率高，符合GB/T 2741—2017《合格評(píng)定化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》的相關(guān)規(guī)定，適合沙棘葉中多酚含量的測(cè)定，可進(jìn)一步應(yīng)用到實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部或企業(yè)日常質(zhì)量控制等場合。采用該方法測(cè)定沙棘葉及多種茶葉中多酚含量，測(cè)得沙棘葉多酚含量為7.99%～14.6%，表明沙棘葉富含多酚，作為茶有較高的利用價(jià)值。