響應面法優化核桃分心木多糖的提取工藝*

劉旋 董一姣 張怡

（運城學院生命科學系，山西運城 044000）

核桃（Juglans regia）又名胡桃、羌桃，胡桃科胡桃屬植物，最早起源于歐洲東南部和西亞等地，目前在世界各地均有分布和栽培，是世界四大干果之一。我國自漢代張騫出使西域將核桃這一新物種引入以來，北起新疆，南至云南，東到遼寧都有核桃的種植和栽培，其中西北、華北為主產地。

核桃分心木為帶骨質內果皮的隔膜，橢圓或類圓形薄片，多彎曲，破碎而不整齊，是核桃加工產生的主要副產物之一，目前主要被丟棄或用作燃料，造成資源極大的浪費。分心木是新疆傳統藥物之一，其藥用價值早在古籍《本草再新》中就有記載，民間也有流傳分心木和茶一起泡飲，有補腎強精、歸脾，治療遺精、遺尿、腰痛和結石等病癥的說法。近年來關于核桃分心木的研究較多，有研究表明，分心木中起主要作用的物質有生物總堿、黃酮、揮發油、多糖、鞣酸、總皂苷等，其中關于分心木黃酮類物質的研究較多，多糖類物質的研究較少。現代研究表明，植物多糖具有抗腫瘤、免疫調節、降血脂、降血糖、預防及治療糖尿病的并發癥等功效。多糖是核桃分心木的主要成分之一，因此本試驗以核桃分心木為原材料，利用水提醇沉法提取多糖，采用單因素和響應面試驗優化核桃分心木多糖的提取工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃分心木，中產2 號，2020年12 月購于山西省萬榮縣。

無水乙醇、乙醚、苯酚、石油醚，天津大茂化學試劑廠；濃硫酸，洛陽市化學試劑廠；所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

Fw177 中草藥粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司；TD5A-WS 臺式冷凍離心機，中國長沙湘立儀器有限公司；Uv-6000PC 可見光分光光度計，上海元析儀器有限公司；DK-98-ⅡA 電熱恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；RE-2000A 旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠；101A-1E 電熱恒溫鼓風干燥箱，上海精宏試驗設備有限公司；SHZ-D循環水式真空泵，鞏義市英峪予華儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品的處理

將核桃分心木置于95 ℃的鼓風干燥箱中干燥，粉碎，過60 目篩，保存備用。

核桃分心木粉末加適量蒸餾水，80 ℃回流提取2 h 過濾，濃縮，加入3 倍體積90%的乙醇，室溫下靜置過夜，4 000 r/min 離心10 min，所得沉淀用乙醚、石油醚交替洗滌2 次，揮干有機溶劑，定容至100 mL，為樣品儲備液。

1.3.2 標準曲線的繪制

準確稱取烘干至恒重的葡萄糖，配成質量濃度為1 mg/mL 的標準溶液。分別移取0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL 標準溶液置于l0 mL比色管中，分別補加蒸餾水至2 mL，各加入mL6%的苯酚溶液，緩慢加入5 mL 濃硫酸，靜置10 min后搖勻，定容至刻線，待測液30 ℃顯色30 min，于490 nm 處測定吸光度（同法處理的蒸餾水做空白對照），以標準系列溶液質量濃度為橫坐標、吸光度值為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線。

1.3.3 單因素試驗對核桃分心木多糖得率的影響

為提高核桃分心木中多糖得率，選擇乙醇體積分數、料液比、浸提溫度和浸提時間為4 個主要影響因素，分別進行單因素試驗。稱取2 g 分心木粉末，按料液比加入一定體積的蒸餾水（30 mL、40 mL、50 mL、60 mL、70 mL），在不同溫度條件下（75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃），回流提取一定時間（60 min、90 min、120 min、150 min、180 min），用3 倍體積不同體積分數的乙醇（60%、70%、80%、90%、100%）對樣品進行沉淀靜置、離心、洗滌，60 ℃下揮干溶劑，計算多糖得率，初步確定最佳提取條件范圍。

1.3.4 響應面優化試驗

根據中心組合試驗設計原理，以核桃分心木多糖得率為響應值，乙醇體積分數、料液比、浸提溫度和浸提時間為響應因子，對核桃分心木提取工藝進行優化。運用Design Expert 8.0 軟件進行響應面分析，并在最佳提取條件下，測定核桃分心木多糖得率，以確定響應面分析法的可靠性和合理性。因素水平編碼見表1。

表1 試驗設計因素及水平取值

1.4 樣品儲備液多糖含量的測定

吸取樣品儲備液2 mL，測定吸光度，根據回歸方程計算樣液中多糖質量濃度（C）。

式中：C—樣液多糖質量濃度，mg/mL；

V—待測液體積，mL；

m—樣品質量，mg；

n—稀釋倍數。

2 結果和分析

2.1 葡萄糖標準曲線

葡萄糖標準曲線如圖1 所示，所得回歸方程為：y=1.781 4x+0.069 8，R2=0.999 1。

圖1 葡萄糖標準曲線

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 乙醇體積分數對核桃分心木多糖得率的影響

分別取不同體積分數乙醇對提取到的多糖溶液進行沉淀，計算分心木多糖得率，探究乙醇體積分數對核桃分心木多糖得率的影響，結果如圖2 所示。

圖2 乙醇體積分數對核桃分心木多糖得率的影響

由圖2 可知，在其他條件不變的情況下，多糖得率因乙醇體積分數的增加而顯著升高；乙醇體積分數超過90%后，對多糖得率的影響作用變小。可能是因為部分多糖分子與醇溶性蛋白結合并隨之溶解在乙醇溶液中，綜合考慮，最終初步確定最佳乙醇體積分數為90%左右。

2.2.2 料液比對核桃分心木多糖得率的影響

分別采用不同的料液比對核桃分心木多糖進行提取，計算分心木多糖得率，探究料液比對核桃分心木多糖得率的影響，結果如圖3 所示。

圖3 料液比對核桃分心木多糖得率的影響

由圖3 可知，在其他條件不變的情況下，多糖得率隨料液比的增加而顯著提高；料液比增大到1∶50 以后，增長趨勢逐漸變緩。由擴散定律可知，隨著溶劑的不斷增加，多糖分子大量溶出，溶劑中多糖總量顯著增加；但繼續增加溶劑，多糖得率增加不顯著，故初步確定最佳料液比為1∶50 左右。

2.2.3 浸提溫度對核桃分心木多糖得率的影響

分別采用不同浸提溫度對核桃分心木多糖進行提取，計算分心木多糖得率，探究浸提溫度對核桃分心木多糖得率的影響，結果如圖4 所示。

圖4 浸提溫度對核桃分心木多糖得率的影響

由圖4 可知，在其他條件不變的情況下，隨著浸提溫度的升高，多糖得率顯著增加。溫度越高，分子擴散速度越快，使得多糖分子大量溶出，提高了多糖得率。所以初步選擇95 ℃作為最佳浸提溫度。

2.2.4 浸提時間對核桃分心木多糖得率的影響

分別采用不同浸提時間對核桃分心木多糖進行提取，計算分心木多糖得率，探究浸提時間對核桃分心木多糖得率的影響，結果如圖5 所示。

圖5 浸提時間對核桃分心木多糖得率的影響

由圖5 可知，在其他條件不變的情況下，隨著浸提時間的延長，多糖得率增加趨勢顯著，并在150 min 達到峰值。浸提時間超過150 min，多糖得率下降。可能是長時間高溫使得部分多糖降解，表現為多糖得率呈現下降趨勢。故選擇150 min 作為多糖的最佳浸提時間。

2.3 響應面分析結果

響應面結果如表2 所示，其中試驗號8、9、21、22、28 為中心試驗，其余為析因試驗。以多糖得率(Y)為響應值，各因素經回歸擬合后，得到二次多項回歸方程為：Y(%)=0.034-6.081×10-4×A-3.859×10-4×B+5.263×10-4×C+7.017×10-4×D-1.754×10-4×AC-1.754×10-4×AD+1.053×10-3×BC+1.754 ×10-4×BD-1.263 ×10-3×CD-3.255 ×10-3×A2-1.799×10-3×B2-1.693×10-3×C2-1.536×10-3×D2。

表2 Box-Behnken 試驗設計方案及結果

回歸模型方差分析結果見下頁表3。由表3 可知，該模型回歸顯著(P＜0.000 1)，失擬項不顯著，R2=0.990 6，說明該回歸模型與實際試驗的擬合程度較為接近，該回歸方程可被用來描述各因子與響應值之間的關系，可用來對核桃分心木多糖得率進行預測。從P值和F值可以看出，對分心木多糖得率影響的大小順序為∶ 浸提時間＞乙醇體積分數＞浸提溫度＞料液比，其中A2、B2、C2、D2項的影響為極顯著，A、D、BC項對分心木多糖得率影響顯著。

表3 回歸模型方差分析

各因素之間的交互作用對分心木多糖得率影響的響應面結果如圖6 所示。從圖6 可以看出，6 個響應面都為開口向下的凸型曲面，表明存在極大值，且響應面曲線較陡，說明該因素的變化對分心木多糖得率的影響越大。

根據圖6（A）響應面的弧度可知：乙醇體積分數不變時，料液比的變化對分心木多糖得率的影響是先升高后下降，趨勢較明顯，當料液比不變時，乙醇體積分數對分心木多糖得率變化趨勢較陡，說明乙醇體積分數對多糖得率的影響比料液比大。同樣從圖6（B）可以得出，乙醇體積分數對多糖得率的影響大于浸提時間。從圖6（C）可以看出，乙醇體積分數對多糖得率的影響大于浸提溫度。由圖6（D）可知，料液比對多糖得率的影響強于浸提時間。由圖6（E）可知，浸提溫度對多糖得率的影響大于料液比。由圖6（F）可知，浸提溫度和浸提時間對多糖得率均有顯著影響，且二者影響程度相當。

圖6 各因素對分心木多糖得率的交互作用

結合回歸模型分析結果可知，水提醇沉法提取核桃分心木多糖的最佳工藝條件為：乙醇體積分數89%，提取溫度95.3 ℃，提取時間156 min，料液比1 g∶49.21 mL，核桃分心木多糖得率為3.54%。為驗證結論、考慮實際可操作性，將分心木多糖最佳提取條件調整為：乙醇體積分數90%、提取溫度95 ℃、提取時間156 min、料液比1 g∶50 mL，并進行3 次驗證試驗。經驗證核桃分心木多糖實際得率為3.53%，與理論預測值基本吻合，證明該模型能較好地預測核桃分心木多糖得率。

3 結論

試驗結果表明，乙醇體積分數、料液比、浸提溫度和浸提時間4 個因素對核桃分心木多糖得率均有影響，各因素按主次排序為：浸提時間＞乙醇體積分數＞浸提溫度＞料液比；水提醇沉法提取核桃分心木多糖的最優工藝參數為：乙醇體積分數90%，料液比1 g∶50 mL，浸提溫度95 ℃，浸提時間156 min，在此條件下，多糖得率為3.44%，接近響應面預測值。