清熱活血湯改善大鼠心肌缺血再灌注損傷的藥效成分及作用機制研究 Δ

李睿 ，紀樹亮 ，章潔淳 ，孫治中 ，楊曉丹 ，劉煜德 ，鄺棗園 ，卿立金 ，吳偉 （.廣州中醫藥大學第一附屬醫院心血管科，廣州 000；.廣州中醫藥大學第一臨床醫學院，廣州 000；.廣州醫科大學附屬中醫醫院呼吸科，廣州 000；.廣州中醫藥大學基礎醫學院，廣州 000）

隨著再灌注治療如經皮冠脈介入術（percutaneous coronary intervention，PCI）的普及，急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）的病死率顯著降低。然而，隨著冠心病患者數量逐年增加，AMI-PCI術后無復流現象、微循環障礙、心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI）等并發癥日益突出[1]。廣東省名中醫吳偉教授基于冠心病熱毒血瘀病機所創制的清熱活血湯（由毛冬青、黃芩、川芎、赤芍、降香、紅花、丹參組成）是廣州中醫藥大學第一附屬醫院治療AMI-PCI術后的協定方劑，已廣泛運用于臨床20余年，療效確切。為使更多患者獲益，醫院擬對其進行制劑開發及成果轉化。本課題組前期研究表明，清熱活血湯能改善AMI-PCI術后患者圍術期臨床癥狀、短期及遠期預后，減少心血管終點事件的發生，且可通過調控自噬改善AMI模型大鼠的心肌組織損傷[2―4]，但對MIRI的影響及具體機制尚未明確。超高效液相色譜質譜聯用（ultraperformance liquid chromatography-tandem mass spec‐trometry，UPLC-MS）技術具有高通量、高分辨率、高靈敏度的特點，適用于分析包括難揮發或熱穩定性差的代謝產物。本研究旨在探討清熱活血湯對MIRI模型大鼠的改善作用，并基于UPLC-MS技術分析其藥效成分及相關機制，為后續制劑開發提供思路。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有BL-420I型動物信號采集與處理系統（成都泰盟科技有限公司），Pannoramic MIDIⅡ型數字病理切片掃描儀（濟南丹吉爾電子有限公司），TGL-16MS型臺式高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司），LNG-T98型冷凍濃縮離心干燥器（太倉市華美生化儀器廠），QE型高分辨質譜儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；Nexera UPLC型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）。

1.2 主要藥物與試劑

清熱活血湯的中藥配方顆粒由廣東一方制藥有限公司生產，其方劑組成為黃芩15 g、毛冬青30 g、丹參30 g、赤芍15 g、川芎15 g、降香6 g、紅花10 g。戊巴比妥鈉鹽（貨號57330）購自美國Sigma公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒（貨號A001-1）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）試劑盒（貨號A005）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒（貨號A003-1）均購自南京建成生物科技有限公司；多聚甲醛固定液（貨號G1101-500ML）、蘇木素-伊紅（HE）染液試劑盒（貨號G1003）、TUNEL試劑盒（貨號G1501）均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；L-2-氯苯丙氨酸（內標，批號C2001，純度98%）購自上海恒創生物科技有限公司。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級雄性SD大鼠，5～7周齡，體質量180～220 g，共42只，購自南方醫科大學實驗動物中心，動物生產許可證號為SCXK（粵）2021-0041。大鼠飼養于廣州中醫藥大學第一附屬醫院SPF級動物房，實驗動物的使用遵循3R原則。所有實驗操作均獲得廣州中醫藥大學第一附屬醫院實驗動物倫理委員會的審批，批準號為TCMF1-2021044。

2 方法

2.1 動物分組、造模與給藥

將SD大鼠適應性喂養1周后，隨機分為假手術組，模型組，清熱活血湯低、中、高劑量組（4.94、9.88、19.79 g/kg，參考文獻[5]方法進行人鼠等效劑量換算，中劑量為等效劑量），清熱活血湯含藥血清組（19.79 g/kg），空白血清組，每組6只。各給藥組大鼠灌胃相應藥物，空白血清組、假手術組、模型組灌胃等量生理鹽水，每天1次，連續2周。于末次給藥12 h后，模型組和清熱活血湯各劑量組復制MIRI大鼠模型，假手術組僅穿線不結扎，具體參考文獻[6]進行造模：大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（1.5 mL/kg）進行麻醉，行氣管內插管并連接呼吸機輔助通氣，鈍性分離皮下各層肌肉后剪斷第3肋骨以暴露心臟，在肺動脈圓錐與左心耳交界下2 mm處用帶有5-0縫合線的圓針進針，對冠脈左前降支近中段行活結結扎（進針深度2 mm，寬度3～4 mm）；缺血（左室前壁心肌發白、心電圖ST段抬高0.1 mV以上為缺血標志）30 min后松開活結再灌注90 min，若再灌注時左室前壁缺血心肌部分恢復紅潤，且心電圖ST段下降50%以上則造模成功。后續取上述5組大鼠全血及心臟組織進行實驗。空白血清組和清熱活血湯含藥血清組大鼠不進行MIRI造模，于末次給藥2 h后經腹主動脈取血，血樣室溫靜置2 h后，以3 000 r/min離心15 min，取上清液，置于－80 ℃冰箱中保存備用。

2.2 大鼠心臟組織病理學形態觀察

將“2.1”項下假手術組、模型組和清熱活血湯各劑量組大鼠心臟組織使用預冷0.9%氯化鈉溶液清洗后固定于4%多聚甲醛中24 h，然后進行梯度乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋及切片。根據試劑盒說明書方法操作，取上述部分切片（剩余部分進行細胞凋亡水平檢測）以二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化后，進行HE染色，采用數字病理切片掃描儀觀察大鼠心臟組織的病理學形態變化。

2.3 大鼠心臟組織中細胞凋亡水平的檢測

取“2.2”項下剩余切片按TUNEL試劑盒說明書方法操作后，采用數字病理切片掃描儀掃描觀察，并隨機選取6個視野使用Image J軟件計算心臟組織細胞凋亡率，細胞凋亡率（%）＝綠色熒光細胞數/藍色熒光細胞數×100%。

2.4 大鼠清熱活血湯含藥血清和空白血清的UPLCMS分析

2.4.1 血清樣本的預處理 將“2.1”項下空白血清組和清熱活血湯含藥血清組的血清樣本取出解凍，移取樣本100 μL，加入內標（0.06 mg/mL L-2-氯苯丙氨酸）20 μL，渦旋震蕩10 s；加入蛋白沉淀劑300 μL渦旋震蕩1 min，再于冰水浴中超聲（功率360 W，頻率40 kHz，下同）提取10 min后，于－20 ℃條件下靜置30 min；靜置后，將樣本于4 ℃條件下以13 000 r/min離心10 min，取上清液200 μL裝入UPLC-MS進樣小瓶中揮干溶劑。樣本殘渣以300 μL甲醇復溶（渦旋30 s，超聲3 min）后，離心10 min，吸取上清液150 μL，以0.22 μm微孔濾膜過濾后，進行UPLC-MS分析。每組平行6份樣本。

2.4.2 UPLC-MS條件 （1）色譜條件：色譜柱為ACQUITYUPLC HSS T3（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；柱溫為45 ℃；流動相為0.1%甲酸（A）-乙腈（B，含0.1%甲酸），梯度洗脫（0～2 min，5%B；2～4 min，5%B→30%B；4～8 min，30%B→50%B；8～10 min，50%B→80%B；10～14 min，80%B→100%B；14～15 min，100%B；15～16 min，100%B→5%B）；流速為0.35 mL/min；進樣體積為2 μL。（2）質譜條件：離子源為ESI；質荷比掃描范圍為100～1 200；一級全掃描分辨率為7×105；噴霧電壓（V）為3 500（+）、－3 000（－）；鞘氣流速（Arb）為40（+）、35（－）；輔氣流速（Arb）為10（+）、8（－）；毛細管溫度為320 ℃；質譜信號采集分別采用正負離子掃描模式。

2.4.3 數據預處理 UPLC-MS原始數據采用Progenesis QI v2.3軟件進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊和歸一化。化合物的鑒定基于精確質量數、二級碎片及同位素分布，并使用HMDB（http：//www.hmdb.ca/）、Lipidmapsv2.3（https：//dev.lipidmaps.org/）和METLIN（http：//enigma.lbl.gov/metlin/）數據庫進行定性分析。筆者基于提取出的數據，將組內缺失值（即離子峰值為0）＞50%的化合物的所有離子峰以極小值的1/2進行替換，并根據化合物定性結果打分進行篩選[篩選標準為≥36分（滿分60分）；＜36分視為定性結果不準確，則排除[7]]，最后將正負離子數據合并為一個數據矩陣表，后續研究則以此表為基礎進行分析。

2.4.4 藥效成分分析 基于“2.4.3”項下鑒定所得化合物，以P＜0.05、差異倍數（fold change，FC）≥1.2為篩選條件，篩選清熱活血湯含藥血清相對于空白血清含量較高的化合物，然后與黃芩、毛冬青、川芎、赤芍、降香、紅花、丹參在TCMSP（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）、SYMMAP（http：//www.symmap.org/）、HERB（http：//herb.ac.cn/）數據庫中收錄的化學成分進行交集，以確認清熱活血湯含藥血清中的主要藥效成分。

2.4.5 差異代謝物及代謝通路分析 基于“2.4.3”項下鑒定所得化合物，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）、偏最小二乘分析（partial least squares dis‐crimination analysis，PLS-DA）及正交偏最小二乘判別分析（orthogonal partial least-squares discrimination analysis，OPLS-DA）來區分清熱活血湯含藥血清組與空白血清組之間代謝輪廓的總體差異[7]。采用OPLS-DA中變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）值及t檢驗篩選組間差異代謝物（篩選標準為VIP值＞1，P＜0.05）[8]。 采 用 HMDB、METLIN、KEGG（https：//www.kegg.jp/）數據庫對差異代謝物進行指認并基于KEGG數據庫進行代謝通路富集分析。

2.5 大鼠血清中氧化應激指標水平的檢測

取假手術組、模型組和清熱活血湯低、中、高劑量組大鼠的全血樣本適量，于4 ℃下以3 000 r/min離心15 min。取上清液，根據試劑盒說明書方法操作后，采用比色法檢測大鼠血清中SOD、MDA、GSH-Px水平。

2.6 統計學方法

實驗數據采用SPSS 24.0進行統計學分析，計量資料符合正態分布以±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗（方差齊時）或Dunnett’s T3檢驗（方差不齊時）。檢驗水準α＝0.05。

3 結果

3.1 大鼠心臟組織病理形態學觀察結果

假手術組大鼠心肌細胞纖維排列整齊、肌節清晰緊密。模型組大鼠大部分心肌細胞腫脹變形、肌絲斷裂，組織間隙水腫、白細胞浸潤較明顯。清熱活血湯各劑量組心肌細胞紊亂、心肌纖維斷裂有所改善，且隨著給藥劑量的增加，改善越明顯。結果見圖1。

圖1 各組大鼠心臟組織的病理形態學顯微圖（HE染色，×200）

3.2 大鼠心臟組織中細胞凋亡水平的檢測結果

與假手術組[（1.25±0.34）%]比較，模型組大鼠心臟組織中細胞凋亡率[（38.62±5.75）%]顯著升高（P＜0.05）。與模型組比較，清熱活血湯低、中、高劑量組大鼠心臟組織中細胞凋亡率[分別為（24.59±1.17）%、（21.41±3.03）%、（15.86±3.06）%]均顯著降 低（P＜0.05），且清熱活血湯高劑量組細胞凋亡率顯著低于中、低劑量組（P＜0.05）。結果見圖2。

圖2 各組大鼠心臟組織中細胞凋亡的熒光圖（TUNEL染色，×200）

3.3 清熱活血湯含藥血清的藥效成分分析

清熱活血湯含藥血清中相對含量較高的化學成分共有1 137種，與黃芩、毛冬青、川芎、赤芍、降香、紅花、丹參在相關數據庫中所收錄的1 402種化學成分進行交集后，得出清熱活血湯含藥血清中共有20種主要藥效成分，包括黃芩苷、琥珀酸、黃芩素、隱丹參酮、異阿魏酸、原兒茶醛、丹酚酸G、3，4-二羥基肉桂酸、異紅花素等，其中黃芩苷的相對含量較高。結果見圖3、表1。

表1 清熱活血湯含藥血清中的主要藥效成分

圖3 正、負離子模式下清熱活血湯含藥血清代謝成分的總離子流圖

3.4 差異代謝物的多元統計學分析結果

清熱活血湯含藥血清組和空白血清組的血清樣本數據經無監督PCA模型（R2X＝0.577）及PLS-DA模型（R2X＝0.807，R2Y＝0.997，Q2＝0.97）預測后發現，模型可靠性較好，組間總體代謝成分存在差異。進一步經OPLS-DA 模型（R2X＝0.731，R2Y＝0.986，Q2＝0.908）預測后發現，R2Y和Q2均接近于1，結合Splot-OPLS-DA圖結果提示兩組間血清總體代謝譜差異顯著。結果見圖4。

圖4 清熱活血湯含藥血清組和空白血清組大鼠血清樣本的多元統計學分析結果

3.5 差異代謝物的通路富集分析

本研究共篩選出29種差異代謝物，共參與35條代謝通路。其中，清熱活血湯可上調L-異亮氨酸、左旋精氨酸、檸檬酸、谷胱甘肽、β-D-葡萄糖、左旋肉堿、瓜氨酸、異丙腎上腺素、D-核糖、D-葡萄糖醛酸等15種代謝物水平（P＜0.05），可下調花生四烯酸、3-磷酸-d-甘油磷酸酯、亞油酸、二十二碳六烯酸、磷脂酰膽堿、溶血磷脂酰膽堿、棕櫚酰肉堿、4-羥脯氨酸、葡萄糖苷酸、碘化酪氨酸等14種代謝物水平（P＜0.05）。上述差異代謝物主要涉及精氨酸生物合成、亞油酸代謝、檸檬酸循環、糖酵解/糖異生途徑、磷酸戊糖途徑、脂質降解調節、血管平滑肌收縮、鐵死亡、瞬時感受器電位（transient receptor potential，TRP）通道炎癥介質調節，以及哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mamma‐lian target of rapamycin，mTOR）信號通路等代謝途徑。

3.6 大鼠血清中氧化應激指標水平的檢測結果

與假手術組比較，模型組大鼠血清中MDA水平顯著升高（P＜0.05），SOD、GSH-Px水平均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，清熱活血湯各劑量組大鼠上述指標（低劑量組SOD除外）水平均顯著逆轉（P＜0.05），且具有一定的劑量依賴趨勢。結果見表2。

表2 各組大鼠血清中氧化應激指標水平的檢測結果（±s，n＝6）

表2 各組大鼠血清中氧化應激指標水平的檢測結果（±s，n＝6）

a：與假手術組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05；c：與清熱活血湯低劑量組比較，P＜0.05；d：與清熱活血湯中劑量組比較，P＜0.05

GSH-Px/（U/mL）394.52±35.23 104.88±33.43a 187.14±27.30b 271.43±27.70bc 335.71±22.23bcd組別假手術組模型組清熱活血湯低劑量組清熱活血湯中劑量組清熱活血湯高劑量組MDA/（nmol/mL）7.36±1.50 52.66±5.32a 33.65±3.99b 15.14±3.15bc 10.09±2.33bc SOD/（U/mL）387.11±20.85 211.66±23.14a 246.87±17.91 271.33±21.79b 338.11±20.52bcd

4 討論

心肌梗死面積是AMI患者預后的決定性因素，再灌注治療可誘發心肌缺血期間并不存在的損傷或使已有損傷加重，其所造成的心肌損傷甚至可達50%心肌梗死面積[9]。因此，抑制MIRI，減少心肌梗死面積，從而減少介入術后心力衰竭及心室重構的發生，是心肌保護治療策略的重要方向。清熱活血湯方中黃芩清熱燥濕、瀉火解毒，毛冬青清熱解毒、活血通脈，君臣配伍為主藥；丹參、赤芍、川芎、紅花力佐活血化瘀之功，降香理氣助使活血止痛；幾者并用共奏清熱解毒、活血化瘀之效。基于此，本課題組探討了清熱活血湯改善模型大鼠MIRI的藥效成分及相關作用機制。

4.1 清熱活血湯對MIRI模型大鼠的影響及藥效成分分析

本研究結果顯示，模型組大鼠心肌組織損傷嚴重，而清熱活血湯各劑量組大鼠心肌組織損傷減輕，細胞凋亡率顯著降低。應用UPLC-MS確認了清熱活血湯含藥血清中20種主要藥效成分，包括黃芩苷、琥珀酸、黃芩素、隱丹參酮、異阿魏酸、原兒茶醛、丹酚酸G、3，4-二羥基肉桂酸、異紅花素等。相關研究發現，黃芩苷可通過抑制Janus激酶/轉錄激活因子信號通路促進MIRI模型大鼠心肌巨噬細胞M2型極化，并通過抗炎、抗氧化、抑制內質網應激等作用改善MIRI模型大鼠的心肌損傷及血管內皮功能[10―12]。原兒茶醛可通過調節核因子κB信號通路抑制炎癥反應，從而改善MIRI模型大鼠的心肌損傷[13]。隱丹參酮可通過上調心肌細胞中內皮型一氧化氮合酶的磷酸化水平，發揮保護心肌組織的作用[14]。3，4-二羥基肉桂酸可通過誘導MIRI模型大鼠心肌組織胞外信號調節激酶磷酸化，降低B細胞淋巴瘤2相關X蛋白表達，抑制大鼠心肌細胞凋亡[15]。這提示，上述成分可能是清熱活血湯改善MIRI模型大鼠心肌損傷的藥效成分基礎。

4.2 清熱活血湯改善MIRI的差異代謝物及代謝通路分析

4.2.1 改善心肌能量代謝 MIRI造成的缺血缺氧心肌于再灌注期間進一步損傷、凋亡或壞死，其病理生理機制涉及能量代謝障礙、氧化應激損傷、鈣超載、內質網應激、細胞壞死與凋亡等多種機制[16]。其中，心肌能量代謝障礙是始發因素，缺血期間心肌細胞脂肪酸有氧代謝受到抑制，無氧糖酵解供能增加，導致乳酸等代謝物堆積；而再灌注期間脂肪酸氧化代謝增多，但脂肪酸的低效供能可導致細胞氧耗增多，同時糖有氧酵解被抑制而導致糖代謝的酸性中間產物進一步增加，造成細胞內酸中毒[17]。本研究結果顯示，清熱活血湯含藥血清中涉及氨基酸合成通路的異亮氨酸、左旋精氨酸、瓜氨酸等代謝物，以及涉及檸檬酸循環、糖酵解/糖異生途徑、磷酸戊糖途徑的檸檬酸、D-核糖、D-葡萄糖醛酸、β-D-葡萄糖等代謝物均顯著上調；其中，異亮氨酸、精氨酸又為生糖氨基酸，D-核糖是機體重要的五碳糖，可加快心肌細胞ATP合成。另外，清熱活血湯含藥血清中3-磷酸-d-甘油磷酸酯、二十二碳六烯酸、亞油酸、磷脂酰膽堿等脂質代謝物均顯著下調，而脂肪酸β-氧化必需的輔助因子——左旋肉堿釋放增加。這提示，清熱活血湯可調節機體能量代謝途徑，減少脂質代謝，促進非必需氨基酸合成、糖異生及糖酵解，進而改善MIRI。

4.2.2 調節炎癥損傷、氧化應激及自噬通路 再灌注期間細胞能量供應仍不足，Na+-K+-ATP酶活性下降，導致大量Ca2+內流引發鈣超載[18―19]。鈣超載可激活氧自由基底物，從而加速活性氧（reactive oxygen species，ROS）形成，ROS可對磷脂膜、蛋白和DNA功能結構造成直接破壞[20―21]，并激活核因子κB信號通路活性，促進炎癥因子及炎癥細胞的釋放，進而加重心肌損傷；同時可引發細胞內質網應激及線粒體損傷，誘導細胞凋亡[22]。本研究結果顯示，清熱活血湯含藥血清中涉及磷酸戊糖途徑的D-核糖、β-D-葡萄糖代謝物及谷胱甘肽水平顯著上調。磷酸戊糖途徑的激活有助于維持谷胱甘肽水平，而谷胱甘肽是體內ROS的強效清除劑，有助于拮抗MIRI所致的心肌組織氧化應激損傷[23]。這提示，清熱活血湯可通過抗氧化作用改善MIRI。

花生四烯酸次級產物血栓烷素A2和白細胞三烯具有促血小板聚集及促炎癥作用，其羥化酶代謝產物20-羥基二十碳四烯酸具有收縮血管及誘導ROS生成、血管內皮紊亂及心肌細胞凋亡等作用[24]；溶血磷脂酰膽堿具有促進血管平滑肌收縮、血小板聚集及誘導心肌動作電位紊亂和心肌細胞鈣循環障礙的作用[25]。本研究結果顯示，清熱活血湯含藥血清可下調涉及TRP通道炎癥介質、鐵死亡及血管平滑肌收縮代謝途徑的溶血磷脂酰膽堿、花生四烯酸、棕櫚酰肉堿水平，上調谷胱甘肽水平。上述代謝途徑均與MIRI預后密切相關[26―27]。這提示，清熱活血湯有助于改善MIRI所致的心肌組織炎癥浸潤、微循環障礙及氧化應激相關性損傷。此外，清熱活血湯含藥血清可上調涉及mTOR信號通路的左旋精氨酸。mTOR是調控細胞自噬的關鍵靶點[28]，這提示清熱活血湯改善MIRI的作用可能與自噬機制有關。

MDA是脂類過氧化的最終代謝產物，是反映組織氧化損傷的客觀指標，而SOD、GSH-Px作為抗氧化酶可有效清除超氧陰離子及脂類過氧化物自由基以維持細胞穩態[29]。基于此，通過對該類指標的檢測可對上述氧化應激相關代謝物及代謝途徑進行表型驗證。本研究結果顯示，清熱活血湯可呈劑量依賴地改善MIRI模型大鼠血清中氧化應激相關指標水平。

綜上所述，清熱活血湯可改善MIRI模型大鼠心臟組織損傷，其藥效成分包括黃芩苷、隱丹參酮、異阿魏酸、原兒茶醛等，其作用機制可能與改善心肌能量代謝、下調氧化應激水平、抑制炎癥浸潤有關。