化橘紅中展青霉素含量測定方法的建立 Δ

謝思敏 ，陳俊妃 ，侯惠嬋 ，顧利紅 ，栗建明 ，王艷慧 （.廣州市藥品檢驗所/國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，廣州 5060；.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣州 5055）

展青霉素（patulin）又稱棒曲霉素、珊瑚青霉毒素，是一種由青霉（penicillium）、曲霉（aspergillus）、絲衣霉菌（byssochlamys）3屬16種真菌產生的有毒代謝產物[1]，具有明顯的基因、遺傳、免疫、細胞及神經毒性[2―7]。展青霉素最先在霉爛蘋果中發現[8]，而作為藥食兩用的山楂、紅棗、烏梅、肉桂、小茴香、干姜等產品均存在展青霉素污染的現象[9―11]。針對展青霉素的污染現狀及相關研究結果，各國相關部門均對其制定了限量標準，比如我國GB 2761－2017《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》規定蘋果、山楂等制品中展青霉素的限量為50 μg/kg。

化橘紅為蕓香科植物化州柚Citrus grandis ‘Tomen‐tosa’或柚C. grandis（L.） Osbeck的未成熟或近成熟的干燥外層果皮，屬于嶺南地區道地藥材，為“粵八味”和“十大廣藥”之一。該藥具有理氣寬中、燥濕化痰的功效，主要用于咳嗽痰多、食積傷酒、嘔惡痞悶的治療[12]?；偌t與蘋果、山楂等相似，同為果實類藥材，其飲片傳統炮制過程為用水悶潤后切絲或塊，再干燥；同時也有采用新型炮制工藝的，即產地趁鮮加工與炮制一體化技術。若炮制過程操作不當或貯藏條件不規范，就容易使藥材受到真菌毒素的污染，這不僅影響藥材的質量，還造成一定的安全隱患，威脅患者生命健康。因此，本研究擬對化橘紅藥材中的展青霉素進行檢測。

目前，展青霉素常用的檢測方法有薄層色譜法、高效液相色譜（HPLC）法、氣相色譜-質譜聯用法和液相色譜-質譜聯用法，其中薄層色譜法的準確性較差，HPLC法易受糠醛類物質的干擾，氣相色譜-質譜聯用法需要對樣品進行衍生化，操作較繁瑣?；偌t藥材中富含多糖、黃酮、香豆素、揮發油等成分，基質復雜，而液相色譜-質譜聯用法分離能力強、檢測限低、靈敏度高，適用于復雜基質中展青霉素的檢測[11]。因此，本研究采用高效液相色譜-串聯三重四極桿質譜聯用（HPLC-MS/MS）法測定化橘紅中展青霉素的含量，以期為化橘紅外源性有害物質殘留控制的研究提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

LCMS-8050型超快速HPLC-MS/MS儀（包括LC-30AD型二元泵、SIL-30AC型自動進樣器、CTO-40C型柱溫箱等）購自日本Shimadzu公司；AG245型十萬分之一電子分析天平購自瑞士Mettler-Toledo公司；Milli-Q超純水處理系統購自德國Merck Millipore公司；T25型高速勻漿儀購自德國IKA公司；ST16型高速離心機購自美國Thermo Fisher Scientific公司；N-EVAP型氮吹儀購自美國Organomation公司。

1.2 主要藥品與試劑

展青霉素對照品溶液（批號S056149，質量濃度100 μg/mL）、SHIMSEN 228型固相凈化柱（適用于展青霉素，批號S19121306）均購自日本Shimadzu公司；果膠酶（批號SLBT6394）購自美國Sigma公司；無水硫酸鎂-無水醋酸鈉（4∶1，m/m）混合粉末（批號623831112A）購自美國Waters公司；乙酸、乙腈均為色譜純，水為超純水。20批化橘紅藥材飲片收自3個產地，均經廣州市藥品檢驗所侯惠嬋主任中藥師鑒定為真品（樣品信息見表1）。

表1 20批化橘紅樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為島津Shim-pack XR-ODS（3.0 mm×75 mm，2.2 μm）；流動相為水（A）-乙腈（B），梯度洗脫（0～5 min，5%B；5～5.1 min，5%B→40%B；5.1～6.5 min，40%B；6.5～6.6 min，40%B→95%B；6.6～10 min，95%B；10～10.1 min，95%B→5%B）；流速為0.3 mL/min；柱溫為25 ℃；進樣量為5 μL。

2.2 質譜條件

采用電噴霧離子源（electron spray ionization，ESI），以負離子模式進行分析；脫溶劑管溫度為526 ℃，加熱模塊溫度為400 ℃，接口溫度為300 ℃；霧化氣流速為3 L/min，干燥氣流速為10 L/min，加熱氣流速為10 L/min。采用多反應監測（multiple reaction monitoring，MRM）模式，選擇質荷比（m/z）153.3→80.9、m/z 153.3→109.2的離子對為檢測離子對，碰撞電壓分別為14、13 V。

2.3 對照品溶液的制備

精密量取展青霉素對照品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，制成質量濃度為10 μg/mL的溶液，作為展青霉素對照品貯備液。精密量取該貯備液1 mL，置于10 mL容量瓶中，用2%乙腈（用乙酸調節pH值至2）稀釋至刻度，制成質量濃度為1 000 ng/mL的對照品溶液，即得。

2.4 供試品溶液的制備

取化橘紅樣品粉末（過二號篩）約4 g，精密稱定，置于具塞離心管中，加水30 mL溶散，加果膠酶75 μL，混勻，40 ℃下放置2 h，精密加入乙腈60 mL，高速勻漿2 min（轉速10 000 r/min），離心10 min（轉速4 000 r/min）。取上清液20 mL，加入無水硫酸鎂-無水醋酸鈉（4∶1，m/m）混合粉末1.5 g，充分振搖2 min，離心10 min（轉速4 000 r/min）。取上清液9 mL通過固相凈化柱，收集凈化液，混勻。精密量取5 mL，置帶刻度試管中，加入乙酸50 μL，40 ℃條件下用氮氣吹至近干，以2%乙腈溶液（用乙酸調節pH值至2）定容至1 mL，渦旋混勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，取續濾液，即得。其總離子流圖見圖1A。

圖1 化橘紅中展青霉素含量測定的總離子流圖

2.5 系列基質對照品溶液的制備

取空白基質樣品（序號12，由預實驗結果得知該樣品不含展青霉素）4 g，按“2.4”項下方法處理至“40 ℃條件下用氮氣吹至近干”，分別精密加入“2.3”項下展青霉素對照品溶液5、10、20、50、100、150、200 μL，再用2%乙腈溶液（用乙酸調節pH值至2）定容至1 mL，渦旋混勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，取續濾液，即得質量濃度分別為5、10、20、50、100、150、200 ng/mL 的系列基質對照品溶液。其總離子流圖見圖1B。

2.6 線性關系考察

取“2.5”項下系列基質對照品溶液，按“2.1”“2.2”項下條件進樣測定，記錄峰面積。以峰面積（Y）對基質對照品的質量濃度（X）進行線性回歸，繪制標準曲線，權重系數設為1/x，可得線性回歸方程為Y＝9 152.74X－12 285.2（r＝0.999 6）。結果表明，展青霉素的檢測質量濃度在5～200 ng/mL 范圍內與峰面積成良好的線性關系。

2.7 靈敏度試驗

按“2.5”項下制備不同質量濃度的展青霉素基質對照品溶液，按“2.1”“2.2”項下條件進樣測定，以信噪比（S/N）為3時測得的量作為檢出限，S/N＝10時測得的量作為定量限。結果顯示，其定量限為6 μg/kg，檢出限為3 μg/kg。

2.8 精密度試驗

精密吸取“2.5”項下基質對照品溶液（質量濃度為50 ng/mL）5 μL，按“2.1”“2.2”項下條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果顯示，峰面積的RSD為1.83%（n＝6），表明該方法精密度良好。

2.9 重復性試驗

稱取同一批樣品（序號12），每份約4 g，精密稱定，平行6份，分別置于具塞離心管中，精密加入“2.3”項下展青霉素對照品貯備液60 μL，按“2.4”項下方法制備供試品溶液。分別精密吸取5 μL，按“2.1”“2.2”項下條件進樣測定，記錄峰面積并以外標法計算樣品含量。結果顯示，樣品含量的RSD為5.28%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.10 加樣回收率試驗

稱取同一批樣品（序號12），每份約4 g，精密稱定，置于具塞離心管中，分別精密加入“2.3”項下展青霉素對照品貯備液12、60、120 μL，每個水平平行3份，分別作為低、中、高3個濃度水平的加樣回收試驗樣品。按“2.4”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取5 μL，按“2.1”“2.2”項下條件進樣測定，計算加樣回收率，結果見表2。

表2 展青霉素的加樣回收率試驗結果（n＝3）

2.11 穩定性試驗

取“2.10”項下的供試品溶液，分別于制備后0、2、6、12 h按“2.1”“2.2”項下條件進樣測定，記錄峰面積。結果顯示，峰面積的RSD為5.82%（n＝4），表明供試品溶液在制備后12 h內穩定性良好。

2.12 樣品測定

取20批化橘紅樣品各適量，分別按“2.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”“2.2”項下條件進樣分析，記錄峰面積并以外標法計算樣品含量。結果顯示，20批樣品均未檢出展青霉素。

3 討論

3.1 流動相的選擇

流動相的種類和比例會對目標化合物的離子化效率產生影響，從而影響測試方法的靈敏度。展青霉素對熱穩定，在酸性條件下化學性質穩定，在堿性條件下易降解[13]。本研究考察了不同流動相系統（包括0.1%甲酸溶液-乙腈、水-乙腈、水-甲醇）對展青霉素質譜響應的影響。結果表明，流動相系統中加入甲酸后，可明顯降低展青霉素的離子化效率，使儀器靈敏度顯著下降，故0.1%甲酸溶液-乙腈不適合用于展青霉素的測定；而后兩種流動相系統均可獲得較好的質譜響應，但乙腈相對于甲醇的黏度更小，相應的系統壓力也更小，故本研究選擇水-乙腈作為流動相。

3.2 色譜柱的選擇

展青霉素易溶于水，極性大[14]，在C18色譜柱上的保留弱。鑒于此，本研究考察了Aglient ZORBAX Eclipse Plus C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）、Phenomenex Kine‐tex C18（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）、島津 Shim-pack GIST（100 mm×2.1 mm，2 μm）、島津 Shim-pack XRODS（3.0 mm×75 mm，2.2 μm）幾種色譜柱對展青霉素的分離效果。結果表明，島津Shim-pack XR-ODS色譜柱的碳載量高，可以增強展青霉素在色譜柱上的保留，延遲其出峰時間，使其與其他大極性雜質有效分離，避免雜質對測定的干擾和共流出峰的抑制效應，故本研究最終選擇島津Shim-pack XR-ODS色譜柱。

3.3 前處理方法的優化

孟瑾等[15]研究發現，對山楂樣品進行果膠酶酶解處理可明顯提高方法的回收率。這是由于大分子果膠質對展青霉素有包裹作用[1]，僅采用物理和化學提取方式不能完全把展青霉素提取出來，還需同時采用生物提取法，以提高提取和測定方法的準確度。同理，化橘紅中含有大量果膠，因此本研究在化橘紅樣品粉末加水溶散后，進行了果膠酶酶解處理，以盡可能多地提取出展青霉素。

本研究對提取溶劑也進行了考察，比較了乙腈和甲醇的提取效果。結果表明，酶解后的樣品經甲醇提取后的溶液顏色明顯深于乙腈提取液，同時甲醇提取液在加入無水硫酸鎂-無水醋酸鈉（4∶1，m/m）混合粉末固相分散萃取后不分層，無法達到除去大量色素及大極性化合物的目的，最后得到的供試品溶液對展青霉素會產生明顯的基質抑制效應，影響測定的準確性和靈敏度，故本研究采用乙腈作為提取溶劑。同時，本研究還考察了無水硫酸鎂-無水醋酸鈉（4∶1，m/m）混合粉末在1.5 g和3.0 g不同加入量條件下對凈化效果和實驗準確度的影響，結果表明沒有明顯差異，故本研究選擇無水硫酸鎂-無水醋酸鈉（4∶1，m/m）混合粉末的加入量為1.5 g。

展青霉素固相凈化柱是一種直接通過式的雜質吸附型固相萃取柱。樣品溶液直接上樣后，該凈化柱可將雜質吸附于柱體上，從而降低基質雜質對測定結果的影響。隨著雜質斑帶在柱體上的延伸，后續溶液的顏色逐漸變深而最終對樣品的凈化效果產生影響，因此除雜時應避免上樣體積過大而出現過載現象；同時，由于溶液在柱體上有部分的吸附損失，經綜合考慮，本研究最終確定上柱溶液的體積為9 mL。此外，展青霉素在酸性環境中的穩定性較好，而其溶液蒸干后形成的薄膜則不穩定[1]。本研究將通過展青霉素固相凈化柱后的凈化液在40 ℃條件下用氮氣吹至近干，并在使用氮氣前加入50 μL乙酸溶液，可增強展青霉素在整個濃縮過程中的穩定性，同時使溶液在近干狀態下不容易被完全吹干，從而提高實驗的可操作性。但由于化橘紅中展青霉素的含量測定為痕量殘留分析，且樣品的前處理過程比較復雜，這造成了在低濃度加樣水平的回收率差異較大。

4 結語

本研究所收集的20批化橘紅藥材飲片均未檢出展青霉素，提示不管是采用產地趁鮮加工與炮制一體化技術處理的藥材飲片（序號1～5），還是采用傳統悶潤法炮制的藥材飲片（序號6～20），均不會造成化橘紅在加工過程中受到展青霉素污染。本研究所建方法可實現對化橘紅中展青霉素的快速篩查和準確定量，為化橘紅的安全性研究和質量控制提供實驗依據和方法。