消食顆粒化學成分鑒定及其治療功能性消化不良的潛在作用機制研究Δ

余秋香，李思雨，常安，馮佳鑫，張慧 （遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600）

功能性消化不良（functional dyspepsia，FD）指被認為起源于胃十二指腸區域的餐后飽脹不適、早飽感、上腹痛和上腹燒灼感中的1種或多種消化不良癥狀，是一種異質性疾病，臨床較為常見。中醫根據臨床辨證將FD歸屬于“痞滿”“胃脘痛”“積滯”范疇[1]。中醫治則以健脾和胃、消積導滯為主[2]。消食顆粒是由山楂、烏梅、神曲3味中藥精制而成的復方顆粒，臨床上用于脾胃氣滯、食積內停所致的脘腹脹滿、腹瀉便溏。本方中山楂、烏梅、神曲3味中藥聯合使用，具有健脾消食之功，但目前消食顆粒發揮藥理作用的物質基礎尚不清楚。鑒于此，本研究采用超高效液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MS）技術對消食顆粒進行化學成分分析，然后利用網絡藥理學及分子對接技術探究其治療FD的作用靶點，以期為消食顆粒的質量控制及合理利用提供參考依據。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有：Agilent 1290型UPLC儀、Agilent 6550型三重四極桿高分辨質譜儀（配置Dual AJS ESI離子源）[安捷倫科技（中國）有限公司]、JA 21002型精密電子天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用的主要藥品與試劑有：消食顆粒（吉林吉春制藥股份有限公司，批號210110，規格15 g/袋），對照品琥珀酸、檸檬酸、α-亞油酸、L-纈氨酸、蘋果酸（成都埃法生物科技有限公司，批號分別為AF20081654、AF200710101、AF20092333、20050253、20051251，純度均不低于98%），對照品槲皮素、異鼠李素、牡荊素、表兒茶素（中國食品藥品檢定研究院，批號分別為100081-200907、110860-201109、111687-200602、110878-200102，純度均不低于98%），對照品兒茶素、山柰酚、熊果酸、木犀草素（上海源葉生物科技有限公司，批號分別為20111218、B21126、B21403、20120521，純度均不低于98%）。

2 方法

2.1 基于UPLC-Q-TOF-MS技術的消食顆粒化學成分鑒定

2.1.1 混合對照品溶液的制備 分別稱取槲皮素、牡荊素、蘋果酸、檸檬酸、表兒茶素、山柰酚、異鼠李素、熊果酸、琥珀酸、L-纈氨酸、木犀草素、α-亞油酸、兒茶素對照品適量，加甲醇制成各對照品質量濃度均為20.0 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取消食顆粒粉末5.0 g，加60%乙醇制成質量濃度為1.0 g/mL的溶液，超聲（頻率40 kHz，功率100 W）10 min，過0.22 μm微孔濾膜，收集濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 采用Agilent C18色譜柱（50 mm×2.1 mm），以0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）為流動相進行梯度洗脫（0～3 min，95% A；3～5 min，95%A→90% A；5～15 min，90%A→80%A；15～25 min，80%A→55%A；25～35 min，55%A→20%A；35～35.5 min，20%A→95%A；35.5～40 min，95%A）；柱溫為30 ℃；流速為0.4 mL/min；檢測波長為325 nm；進樣量為3 μL；分析時間為40 min，柱色譜洗脫液不經分流直接導入質譜系統檢測。

2.1.4 質譜條件 采用電噴霧離子源（ESI），在正、負離子模式下檢測，二級質譜采集采用Auto MS/MS模式；干燥氣體流速為6 L/min，干燥氣體溫度為250 ℃；毛細管電壓為3 500 V，霧化器壓力為35 psi，碎裂電壓為175 V，二級質譜碰撞電壓為15 eV；質譜采集范圍為質荷比（m/z）100～3 000。

2.1.5 成分鑒定 將“2.1.1”“2.1.2”項下混合對照品溶液和供試品溶液按照“2.1.3”“2.1.4”項下條件進樣分析，獲得正、負離子模式下的總離子流圖。通過一級和二級質譜信息分析并結合相關文獻進行成分鑒定。

2.2 基于網絡藥理學的消食顆粒治療FD的潛在作用機制研究

2.2.1 活性成分及其作用靶點的篩選 選取從消食顆粒中鑒定出的化學成分作為目標成分，將其分別輸入TCMID 數據庫（http：//www.megabionet.org/tcmid/）、中藥分子機制的生物信息分析工具（BATMAN-TCM，http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）及中藥系統藥理學分析平臺數據庫（TCMSP，https：//old.tcmsp-e.com/tc‐msp.php）中，根據口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和Lipinski類藥五原則篩選活性成分[3]。然后利用UniProt數據庫（https：//www.uniprot.org/）獲取靶點蛋白，去重后即得到消食顆粒活性成分的靶點。

2.2.2 FD相關靶點基因的篩選 以“functional dyspepsia”為關鍵詞在GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）、Drugbank 數據庫（https：//go.drugbank.com/）及在線人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM，https：//omim.org/）中進行檢索，獲取與FD相關的靶點基因。

2.2.3 “藥物-成分-靶點”互作網絡的構建 利用生物信息學在線數據庫作圖工具（https：//www.bioinformatics.com.cn/），獲得成分靶點和疾病靶點交集圖。將交集靶點導入STRING數據庫（https：//cn.string-db.org/）中，獲得靶點間相互作用關系并導入Cytoscape 3.9.0軟件，構建蛋白質-蛋白質相互作用（protein-protein interaction，PPI）網絡，同時計算蛋白之間的度值、介度中心度和接近中心度，按大于2倍度值中位數的條件篩選核心靶點蛋白。

2.2.4 基因本體功能注釋和KEGG通路富集 基于DAVID 6.8數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對消食顆粒與FD的交集靶點基因進行基因本體（GO）功能注釋和KEGG通路富集分析，限定物種為“Human（人類）”，保留q值（即校正后的P值）小于0.05的富集條目，并按照q值大小進行排序。GO分析選取排名前10位的富集結果進行分析，KEGG分析選取排名前20位的富集結果進行分析。采用微生信在線數據庫（https：//www.bioin‐formatics.com.cn/）實現富集分析結果的可視化。

2.3 基于分子對接的消食顆粒治療FD的靶點蛋白驗證

從PubChem數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載活性成分的2D結構，保存為“sdf”格式文件，使用chem3D軟件將活性成分的2D結構轉化為3D，以最小自由能對結構進行優化，然后保存為“Mol2”格式文件，即為小分子配體。從RCSB PDB蛋白質數據庫（https：//www.rcsb.org/）中下載蛋白受體的3D結構，導入pymol 2.4.0軟件進行去水、分離配體處理，保存為“pdb”格式文件，即為蛋白受體。使用AutoDock tools軟件確定小分子配體可扭轉鍵，并對蛋白受體進行加氫等處理，然后將小分子配體和蛋白受體均轉存為“pbdqt”格式文件，使用AutoDock vina軟件將小分子配體和蛋白受體進行分子對接，確定核心靶點與核心成分的結合親和力。結合能＞－5～－4.25 kcal/mol表示配體小分子與受體蛋白存在一定活性，＞－7～－5 kcal/mol表示具有較好的活性，≤－7 kcal/mol表示具有很好的活性[4]。

3 結果

3.1 消食顆粒化學成分的鑒定結果

從消食顆粒中共鑒定出53種化學成分，主要為黃酮類和有機酸類化合物，詳見圖1、表1。

圖1 正、負離子模式下消食顆粒UPLC-Q-TOF-MS檢測的總離子流圖

表1 消食顆粒化學成分鑒定結果

續表1

3.2 消食顆粒治療FD的作用機制預測結果

3.2.1 消食顆粒活性成分及其作用靶點的篩選結果采用TCMSP、TCMID及BATMAN-TCM數據庫，在設定的篩選條件下，從消食顆粒中鑒定出的53種主要化學成分中篩選出了23種活性成分（包括槲皮素、山柰酚、異鼠李素等），共獲得潛在核心靶點206個。

3.2.2 FD疾病靶點的篩選結果 從GeneCards、Drug‐bank、OMIM 3個數據庫中共篩選出FD疾病靶點2 711個，獲得成分-疾病交集靶點蛋白147個，將其作為消食顆粒治療FD的潛在靶點。

3.2.3 “藥物-成分-靶點”互作網絡的分析結果 “藥物-成分-靶點”互作網絡分析結果顯示，槲皮素有126條邊，山柰酚有50條邊，異鼠李素有22條邊，蘆丁有18條邊（邊數越多說明與該活性成分相互作用的靶點越多）。通過比較該網絡中各成分的度值，篩選出度值排名前7位的活性成分，分別為槲皮素、山柰酚、熊果酸、β-谷甾醇、豆甾醇、異鼠李素、蘆丁。成分-疾病交集靶點的PPI網絡可視化結果（圖2）顯示，經Cytoscape 3.9.0軟件篩選后最終得到6個核心靶點蛋白，分別為雌激素受體（es‐trogen receptor，ESR1）、雄激素受體（androgen receptor，AR）、信號轉導與轉錄激活因子（signal transducer and activator of transcription，STAT3）、細胞腫瘤抗原（cellu‐lar tumour antigen，TP53）、乳腺癌組織中缺氧誘導因子1亞基α（hypoxia-inducible factor 1 subunit α in breast can‐cer tissue，HIF1A）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（protooncogene tyrosine protein kinase，SRC）。

圖2 成分-疾病交集靶點的PPI網絡可視化圖

3.2.4 GO功能注釋和KEGG通路富集分析結果 GO功能注釋分析結果顯示，共獲得了623個GO條目，包括330個生物學過程（bioprogress，BP）條目、141個細胞組分（cell components，CC）條目和152個分子功能（molicu‐lar function，MF）條目。BP涉及對脂多糖的反應、對細菌來源分子的反應及對缺氧的反應等；CC涉及細胞膜上的膜筏、膜性結構域及膜區域等；MF主要涉及酶結合蛋白同質二聚體活性、細胞核受體活性及配體激活的轉錄因子活性等。

KEGG通路富集分析結果顯示，共獲得173個條目（q值＜0.05），排名靠前的信號通路包括乙型肝炎、流體剪切應力和動脈粥樣硬化、磷脂酰肌醇3-激酶（phospha‐tidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein ki‐nase，MAPK）及晚期糖基化產物（advanced glycosylation products，AGE）-晚期糖基化終末產物受體（receptor for advanced glycosylation end products，RAGE）等，除此之外還有一些腫瘤壞死因子及癌癥信號通路。

3.2.5 消食顆粒主要活性成分與核心靶點蛋白的分子對接結果 分子對接結果顯示，槲皮素、山柰酚、異鼠李素、蘆丁、β-谷甾醇與核心靶點ESR1、AR、STAT3、TP53、HIF1A、SRC的結合能均小于－7.0 kcal/mol，表明其結合活性較強。

4 討論

雖然FD的發病機制尚不完全明確，但現代研究發現，胃腸道運動功能障礙、內臟超敏反應、炎癥反應及精神心理因素等均可能導致FD[10―14]。本研究結果表明，槲皮素、山柰酚、熊果酸、β-谷甾醇、豆甾醇、異鼠李素、蘆丁等化合物在FD的治療中可能發揮重要的作用。相關藥理研究表明，槲皮素具有雙向調節胃腸道平滑肌促進功能性便秘大鼠胃腸動力的作用[15]；豆甾醇可改善脂肪刺激引起內臟高敏感；調節脂肪代謝[16]；熊果酸、β‐谷甾醇及異鼠李素可通過減少炎癥因子釋放發揮抗炎作用，調節機體免疫，進而改善機體損傷[16―18]；蘆丁可保護胃黏膜并抑制胃酸分泌，對消化系統疾病有一定的治療作用；山柰酚不僅具有顯著的抗炎活性，而且可顯著改善慢性應激抑郁模型大鼠的抑郁樣行為，保護神經功能[19]。

通過PPI網絡結果分析，最終篩選出6個核心靶點，分別為 ESR1、AR、STAT3、TP53、HIF1A、SRC。其中ESR1為FD的主要靶點[20]，可通過抑制胃排空、改變胃動力及節律、抑制胃酸分泌發揮作用；AR在腸道固有層的間充質細胞中表達，發揮抑制細胞增殖的作用，與腸道相關疾病的發生發展密切相關[21]。STAT3主要參與調節炎癥免疫反應和胃腸激素分泌從而增強胃腸運動[21]；TP53可使損傷的細胞凋亡，并在消化道疾病中對維持胃腸道黏膜的完整性有著重要作用[22]；SRC作為使消化道疾病發生惡化的作用靶點，常與胃癌的發生、發展密切相關[23]。

GO功能注釋分析結果顯示，消食顆粒可通過多種生物過程、細胞組成及分子功能對FD進行調控。KEGG通路富集分析結果表明，消食顆粒主要通過多條信號通路發揮治療FD的作用，其中乙型肝炎、PI3K-Akt、AGERAGE、MAPK、癌癥等為主要調節信號通路。研究發現，肝功能異常會導致代謝紊亂，而乙型肝炎及丙型肝炎信號通路都會引起肝功能損傷[24]。MAPK信號通路與炎癥反應有關，且與很多肝臟疾病均有密切關系，降低其表達可以促進脂肪的代謝，緩解炎癥反應[25]。現有研究表明，通過激活PI3K-Akt信號通路，可以抑制胃腸道平滑肌細胞的凋亡[26]。胰島素是調節代謝的重要激素，糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路對糖脂代謝起著重要的調節作用[27―28]。癌癥是一種慢性消耗性疾病，腫瘤的生長引發各種消化酶分泌異常、代謝紊亂，從而導致消化不良的癥狀。分子對接結果表明，槲皮素、山柰酚、異鼠李素、蘆丁、β-谷甾醇與靶點STAT3、HIF1A、SRC等均具有較強的結合活性，提示消食顆粒可能是通過調節這些關鍵靶點發揮其藥理作用的。

綜上所述，本文基于UPLC-Q-TOF-MS技術共鑒定出53種消食顆粒的主要化學成分。通過網絡藥理學和分子對接預測，消食顆粒可能是通過槲皮素、異鼠李素、山柰酚等活性成分作用于STAT3、HIF1A、SRC等靶點，調節PI3K-Akt、AGE-RAGE、MAPK等信號通路，從而發揮其對FD的治療作用，但后期需進一步結合藥理學實驗進行驗證。